eng
Выпуск #6/2020
О. В. Градов, Ю. В. Жуланов, П. Ю. Макавеев
Оптическая ультраструктурная вирометрия и ее ограничения
Оптическая ультраструктурная вирометрия и ее ограничения
Просмотры: 1783
DOI: 10.22184/1993-7296.FRos.2020.14.6.542.549
Идентификации типоразмеров вирусных, агрегационных и иных частиц с помощью анализа потока вирионов по спектру светорассеяния и флуоресценции требует предварительной калибровки измерительного инструмента. Калибровка должна идти по конкретным геометрическим прототипам, имеющим определенные размеры. Однако размеры вирусов колеблются в широком диапазоне длин от нано- до субмикрометровых размеров. Это создает неопределенность измерений для широкого ряда вирусов. Программное обеспечение широко внедряемых оптических инструментов базируется на упрощенной интерпретации теории рассеяния света Ми, распространяя ее практически на весь диапазон размеров частиц, даже субмикрометровых. В обзоре рассмотрены метрологические проблемы оптической вирометрии, даны предложения решения вопросов калибровки инструментов.
Идентификации типоразмеров вирусных, агрегационных и иных частиц с помощью анализа потока вирионов по спектру светорассеяния и флуоресценции требует предварительной калибровки измерительного инструмента. Калибровка должна идти по конкретным геометрическим прототипам, имеющим определенные размеры. Однако размеры вирусов колеблются в широком диапазоне длин от нано- до субмикрометровых размеров. Это создает неопределенность измерений для широкого ряда вирусов. Программное обеспечение широко внедряемых оптических инструментов базируется на упрощенной интерпретации теории рассеяния света Ми, распространяя ее практически на весь диапазон размеров частиц, даже субмикрометровых. В обзоре рассмотрены метрологические проблемы оптической вирометрии, даны предложения решения вопросов калибровки инструментов.
Теги: diffusion aerosol spectrometers hydrosol particle counters light-scattering aerosol counters virometry вирометрия гидрозольные счетчики диффузионный аэрозольный спектрометр оптические аэрозольные счетчики
Наряду с оптической цитометрией, базирующейся на анализе флуоресцентного (либо рассеиваемого клеткой [1, 2]) светового сигнала, в последние годы свою эффективность проявили методы вирометрии. Особенно это стало заметно при использовании метода проточной вирометрии [3, 4], получившего свое название по аналогии с проточной цитометрией (FACS, FCM). Комплекс технологий вирометрии – уникальное средство анализа инфекционных профилей [5], антигенных спектров [6], кинетического анализа вирусного инфицирования, а также конформационной кинетики и компаративного анализа химизма отклика, по сравнению с нормой реакции [7]. Основной акцент при анализе делается на молекулярно-биологическом аспекте – а не на ультраморфологических и размерных (дисперсных) отличиях вирусов.
Обратим внимание на тот факт, что Национальные институты здоровья США в рамках своей текущей политики делают акцент на счетном количестве вирусов. Особенно это касается исследований вируса HIV‑1, ответственного за пандемию СПИДа (HIV‑1 относится к подсемейству ретровирусов Lentiviridae [8]). То есть по факту речь идет о чрезвычайно таксономически ограниченном подмножестве релевантных аналитов и препаратов, а также равнозначно ограниченной номенклатуре вариаций вирусов [9–11]. В силу этого говорить об универсальности данного метода в диагностической вирусологии, очевидно, не приходится.
Универсальный метод не может быть основан на селективных (в молекулярно-биологическом аспекте) носителях. Особенно это замечание относится к супрамолекулярным системам с высокой специфичностью комплементарной фиксации, к которым относятся генетические механизмы вирусов. Создать систему, эквивалентно распознающую все типы вирусов, в принципе невозможно. И в этом проявляется ограниченность метода. (Подразумеваются система для ДНК-, так и РНК-; с однонитевым или двухнитевым ДНК‑геномом либо односпиральным или двуспиральным РНК‑геномом; для всех форм капсомеров, т. е. белковых субъединиц / протомеров капсид – внешних вирусных оболочек; с учетом вероятностей обнаружения в пробах как непокрытых дополнительной оболочкой [viral envelope] вирусов, так и вирусов с ксеногенным липидным суперкапсидом). Постановка настолько универсализированной задачи противоречит филетическому многообразию молекулярной таксономии вирусов.
Подчеркнем, что размеры вирусов находятся в диапазоне субволновых длин. Поэтому селективные флуоресцентные методы проточной вирометрии также не обладают универсальностью для обнаружения вирусов различных геометрических форм. Это происходит в силу неразличимости оптического сигнала от них (исключения составляют PALM / STORM‑подобные микрофлуориметрические методы).
Надо учесть, что оборудование, которым оснащены современные центры коллективного пользования (core facilities) [12], имеет ограничения. Например, клеточный анализатор (cell analyzer) BD LSRFortessa SORP оптимизирован под размеры лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов. Метод, заложенный в магнитный флуоресцентный счетчик биочастиц autoMACS Pro, препятствует счету одиночных вирусных частиц. Многоцветный проточный цитометр BD FACS Celesta (с комплектацией лазерами на длинах волн 488, 405, 650, 355 и 561 нм) не имеет возможности измерять структуры, порядка размеров вирусных и иных генетических частиц. Надо учитывать помехи из-за паразитных флуоресцентных сигналов, вызванных излучением УФ‑диапазона (подобные эффекты уже наблюдались ранее при работе с УФ‑микроскопами).
Но если вирусы обладают морфологическим различием (in adjecto – различаются геометрическим типом капсида, белковой оболочки вируса), то индикатрисы рассеяния светового потока будут тоже различаться между собой. Когда капсиды вирусов имеют спиральные, икосаэдрические, продолговатые и комплексные формы, это отражается на форме индикатрисы рассеяния. Правда, стоит учитывать, что эти различия могут уверенно наблюдаться только в приборах, прошедших калибровку.
А процедуры калибровки для таких измерительных систем представляют собой отдельный научный вопрос. Для калибровки должны быть выбраны тестовые частицы, адекватные по геометрии и размерам исследуемым вирусам. В идеале они должны обладать автоморфизмом к геометрическим размерам вирусных частиц. Например, быть вирусом той же морфологии, но инактивированного или непатогенного типа, либо быть гомеоморфной к нему. Морфизм, не обеспечивающий взаимно-однозначного соответствия между структурой исследуемого и калибровочного вируса (калибровочной частицы) не вполне достаточен для идентификации. Причина в том, что несоответствие может стать источником появления артефактов в расшифровываемой дифракционной картине (см. рисунок).
Но в методе проточной вирометрии частиц при сохранении идентичных групп симметрии у калибровочных и измеряемых частиц калибровка с их помощью измерительной системы возможна. Хрестоматийный пример: ротавирус, имеющий икосаэдрическую симметрию эффективно аппроксимируется сферическим паттерном в силу большого количества капсомеров (капсомер – повторяющаяся группа молекул структурного белка вириона, образует упорядоченную структуру капсида. Что, переходя на язык фрактальной геометрии, именуется как пертайлинг) [13].
Разработчики сканирующих проточных спектрометров («BioUniScan», Новосибирск) констатируют, что для определения характеристик частиц необходимо решать обратную задачу светорассеяния. Задача нетривиальная даже для случая наблюдения сферических гомогенных частиц субдлинноволнового диапазона. Предварительная калибровка системы является таким же «ноу-хау», как и управляющий алгоритм / протокол измерений.
Общеизвестно, что размеры вирусов в разных таксономических группах отличаются на порядки величин: от 20 до 300 нм. Хотя некоторые представители семейства Filoviridae с одноцепочечной РНК отрицательной полярности имеют длину до 1,4 мкм при поперечнике 0,08 мкм. А у Pandoravirus sp. и Pithovirus sp. уровень компактизации генома, в принципе, физически допускает выход далеко за границы микрометра 1,0–0,5 мкм / 1,5–0,5 мкм соответственно.
Из чего следует качественное различие метрологии и принципов анализа для этих качественно отличных групп. Несмотря на распространенное упрощение, сводимое к экстраполяции интерпретаций теории рассеяния света Ми практически на весь диапазон размеров частиц (включая дифракцию Фраунгофера как частный случай), хорошо известна неправомерность теории Ми при малых параметрах дифракции. Вычислительные возможности, обеспечиваемые теорией Ми, допускают применение одного метода / алгоритма расчетов для аддитивного спектра дисперсности, то есть размеров частиц.
Выскажем гипотезу, что эта экстраполяция в рамках измерений индикатрис световых пучков, прошедших сквозь поток с вирусами, является заблуждением. По факту, получается, что часть пробы с вирусами будет обсчитана неправильно. Поясним это утверждение.
Использовать упрощенные расчеты возможно только в случае, когда речь идет о монодисперсных калибровочных средах, например специальных латексах. Они обладают гомоскедастичностью статистических распределений. Но при рассмотрении сред, в которых содержатся отдельные частицы, различающиеся как по статической геометрии, так и по динамическим морфометрическим параметрам, проявляется гетероскедастичность распределения. Это приводит к неэффективности оценок, так как невозможно заранее знать значения концентрации отдельных частиц и вклад в дифракционную картину дисперсных фракций (или размеров ультраструктурных и микроструктурных единиц биоматериала). В динамике они отличаются от оценок, выполненных как по статической геометрии, так и по динамическим морфометрическим параметрам. Эти критерии в норме реакции являются нестационарным коррелятом общей реактивности протоплазмы / вироплазмы и распространения возбуждения в ней [14, 15]. А квалиметрический весовой критерий в таких задачах вычислить трудно в силу различий геометрий («форм-факторов») частиц.
Говорят, что «если все частицы в пробе больше, чем длина волны света, часть теории Фраунгофера доминирует в теории Ми при расчетах размеров частиц». Но, учитывая анизометрические частицы (к которым относятся и вирусы – те же Filoviridae с невероятным коэффициентом «прозенхимности», как называлось бы это свойство в случае цитометрии клеток растений, по Тахтаджяну: до 1,4 к 0,08), говорить об объективном численном выражении указанного доминирования (особо – без учета ориентации), не приходится в большинстве фактически реализуемых случаев.
Машиннорешаемые абстрактные модели, применимые для вычисления распределений, базируются на допущении о сферической форме частиц. Поэтому распределение частиц по размеру, получаемое в результате анализа, на самом деле является распределением «эквивалентных сферических частиц», а не реальных частиц аналита. (Напомним, что классическая задача электродинамики, решенная в 1908 году Густавом Ми, решается разложением электромагнитного поля на сферические гармоники).
Для вирусов, различающихся по морфологии и генетическому или эволюционному положению, геометрические отклонения от сферы будут различными. Поэтому эффективность эквивалентных измерений будет отличаться для систематически различных вирусов. Говорить об универсальной технологии «функциональной вирометрии» в таком случае невозможно, поскольку размеры номенклатуры даже наиболее распространенных или релевантных для инфекционистов вирусов экстремально варьируют. Следовательно, дифракционные пределы и границы оптимумов применимости того или иного математического подхода, в том числе отличного от теории Ми, варьируются тоже.
А функциональная активность вирулентно-различных форм, как правило, сравнительно слабо коррелирует с усредненной морфологией, вычисляемой в ходе поточной обработки данных с детектора проточного устройства. Даже при принятии допущения, что измерения вирусов ведутся не на дисперсных носителях, а в абстрактной пустой среде с отсутствием адсорбирующих агентов, калибровка измерительной системы будет неэффективна [16].
Если говорить о недостаточности информации для функциональной идентификации, то следует также упомянуть, что теория Ми требует знания коэффициентов преломления и поглощения образца (очевидно, неидентичного для разных потенциальных вирусов) и «дисперсионной среды», которая в нативном случае также характеризуется некоторой неопределенностью, поскольку необходимо анализировать образцы из различных сред.
Очевидно, что в случае анализа нативных сред, возможности окрашивания вирусных частиц (особенно инактивированных), также существенно ограничены. Эта методика используется для окрашивания SyBR green-I [17, 18]; не фиксированных на дисперсных частицах (нанозолота etc.) либо в агарозных иммобилизующих шариках [19]; для экспрессии флуоресцентных белков, не модифицированных генетически, после проникновения в клетку [20, 21].
Особо сложно идентифицировать, анализировать и измерять в естественной среде распространения инфекционные вирусные агенты, которые передаются аэрозольным (воздушно-капельным) путем. К таковым, из наиболее известных, распространенных и легкодифференцируемых заболеваний, обладающих выраженной этиологией, относится существенный пласт инфекций. Его рассмотрение начинается c ОРВИ (Upper Respiratory Tract Infections; URTI), объединяющего в себе респираторно-синцитиальную вирусную инфекцию, риновирусную и аденовирусную инфекции. Продолжают ряд вирусы гриппа / парагриппа, кори, эпидемического паротита, аденовирусной инфекции и т. д.
Определение вирусов без культивации может быть реализовано только в абиогенной среде их распространения. Поэтому для инфекций, передающихся воздушно-капельным (аэрозольным) путем, необходимо внедрение метода, обеспечивающего анализ с захватом частиц в естественной атмосфере.
В то же время, как правило, в физиологических аэрозолях размер капель может существенно превышать сами размеры вирусов. Однако и в стандартной вирометрии известен эффект агрегации вирусов. Поэтому на стандартных проточных цитометрах (FACS) реализуется методика «вирусной агрегометрии». Именно с ее помощью проходит детектирование HSV‑1 и ряда других агрегирующих вирусных частиц с размерами агрегатов выше предела 300–500 нм.
Эти ограничения могут быть преодолены при использовании лазерных аэрозольных спектрометров. Всплеск интереса к аэрозольным и гидрозольным оптическим счетным системам появился в 1970-х годах [22]. Тогда изучались субмикронные частицы жаркой (аридной) зоны и вариации аэрозольных параметров в высокогорных условиях с повышенной инсоляцией и пониженным давлением [23, 24]. Позже, в 1980-е годы, аэрозольные счетчики Жуланова работали на Венере на советских космических аппаратах ВЕГА‑1 и ВЕГА‑2 [25]. С их помощью проводили изучение структуры облачных слоев и размерное распределение аэрозоля венерианской атмосферы [26, 27], изучали механизм возникновения облачных слоев [28].
Диффузионные аэрозольные спектрометры Жуланова с соавторами осуществляют измерение спектра размеров в диапазоне от размера молекулярных кластеров до долей микрона, то есть могут быть оптимизированы для большинства вирометрических задач, не использующих флуоресцентных меток и гранул (beads). Например, модификация 2702 осуществляет мониторинг в диапазоне 3–200 нм, хотя существует возможность расширения верхнего диапазона до N‑микронных масштабов (вплоть до 10 мкм).
Оптические методы вирометрии субмикронного диапазона имеют высокий потенциал в решении задач анализа причин формирования самоорганизующихся вирусных структур или частиц [29, 30], магнитных гибридных «металлорганических» вирусных частиц [31]). Более того, лазерную аэрозольную спектрометрию можно использовать при решении вопросов выживаемости генетического вирусного материала в космических условиях, а также к смежным проблемам космической биологии / астробиологии и т. н. «космического абиогенеза» на базе зольных частиц [32, 33] или вирусно-опосредованной панспермии (либо астрозольного переноса [34, 35]) и иных проблем газофазной экзобиологии [36, 37].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Оптические методы вирометрии субмикронного диапазона могут быть с успехом имплементированы в любых средах, благоприятствующих размножению вирусного материала или препятствующих таковому. И вопросы подбора калибровочных частиц при лазерно-аэрозольно-спектрометрических изысканиях решаются иначе, если использовать принципы динамического светорассеяния.
АВТОРЫ
Градов Олег Валерьевич, с. н. с., Отдел динамики химических и биологических процессов, Институт химической физики им. Семенова, Москва, Россия.Область интересов: микрофлюидика, патч-кламп, ESEM, CLEM, безлинзовая микроскопия, YMD, DIC, SPIM, LSFM, биофизическое приборостроение
ORCID:0000-0001-5118-6261
Жуланов Юрий Васильевич, к. ф.‑ м. н., с. н. с., Научно-исследовательский физико-химический институт им. Л. Я. Карпова, Москва, Россия.
ORCID: 0000-0003-2494-5693
Макавеев Павел Юрьевич, конструктор аэрозольных спектрометров и счетчиков, Научно-исследовательский физико-химический институт им. Л. Я. Карпова, Москва, Россия.
ORCID: 0000-0002-4026-2828
REFERENCES
Maltsev V. P., Chernyshev A. V., Sem’yanov K. A., Soini E. Absolute real-time measurement of particle size distribution with the flying light-scattering indicatrix method. Applied optics. 1996; 35(18): 3275–3280.
Shvalov A. N., Surovtsev I. V., Chernyshev A. V., Soini J. T., Maltsev V. P. Particle classification from light scattering with the scanning flow cytometer. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 1999; 37 (3): 215–220.
Zamora J. L. R., Aguilar H. C. Flow virometry as a tool to study viruses. Methods. 2018; 134: 87–97.
Zicari S., Arakelyan A., Fitzgerald W., Zaitseva E., Chernomordik L. V., Margolis L., Grivel J. C. Evaluation of the maturation of individual Dengue virions with flow virometry. Virology. 2016; 488: 20–27.
Gaudin R., Barteneva N. S. Sorting of small infectious virus particles by flow virometry reveals distinct infectivity profiles. Nature communications. 2015; 6: 6022.
Arakelyan A., Fitzgerald W., Zicari S., Vagida M., Grivel J. C., Margolis L. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of visualized experiments. 2017; 119.
Landowski M., Dabundo J., Liu Q., Nicola A. V., Aguilar H. C. Nipah Virion Entry Kinetics, Composition, and Conformational Changes Determined by Enzymatic VLPs and New Flow Virometry Tools. Journal of virology. 2014; 88(24): 14197–14206.
Bonar M. M., Tilton J. C. High sensitivity detection and sorting of infectious human immunodeficiency virus (HIV‑1) particles by flow virometry. Virology. 2017; 505: 80–90.
DeSantis M. C., Kim J. H., Song H., Klasse P. J., Cheng W. Quantitative correlation between infectivity and Gp120 density on HIV‑1 virions revealed by optical trapping virometry. Journal of Biological Chemistry. 2016; 291(25): 13088–13097.
Arakelyan A., Fitzgerald W., King D., Barreto-de-Souza V., Zicari S., Grivel J.-C., Shattock R., Margolis L. Some HIV‑1 virions are more equal than others: mosaics of envs on individual HIV virions as evaluated with flow virometry. JAIDS Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 2016; 71: 68.
Arakelyan A., Fitzgerald W., King D. F., Rogers P., Cheeseman H. M., Grivel J., Shattock R. J., Margolis L. Flow virometry analysis of envelope glycoprotein conformations on individual HIV virions. Scientific reports. 2017; 7(1): 948.
University of Florida. Center for Immunology & Transplantation. URL: https://immunology.ufl.edu/instrumentation.
Schroeder M. Fractals, chaos, power laws. – Dover, Mineola, 2009. 430 p.
Nasonov D. N. Mestnaya reakciya protoplazmy i rasprostranyayushcheesya vozbuzhdenie. 2 izd. – M.; L.: Izd-vo AN SSSR, 1962.
Насонов Д. Н. Местная реакция протоплазмы и распространяющееся возбуждение. 2 изд. – М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1962.
Обратим внимание на тот факт, что Национальные институты здоровья США в рамках своей текущей политики делают акцент на счетном количестве вирусов. Особенно это касается исследований вируса HIV‑1, ответственного за пандемию СПИДа (HIV‑1 относится к подсемейству ретровирусов Lentiviridae [8]). То есть по факту речь идет о чрезвычайно таксономически ограниченном подмножестве релевантных аналитов и препаратов, а также равнозначно ограниченной номенклатуре вариаций вирусов [9–11]. В силу этого говорить об универсальности данного метода в диагностической вирусологии, очевидно, не приходится.
Универсальный метод не может быть основан на селективных (в молекулярно-биологическом аспекте) носителях. Особенно это замечание относится к супрамолекулярным системам с высокой специфичностью комплементарной фиксации, к которым относятся генетические механизмы вирусов. Создать систему, эквивалентно распознающую все типы вирусов, в принципе невозможно. И в этом проявляется ограниченность метода. (Подразумеваются система для ДНК-, так и РНК-; с однонитевым или двухнитевым ДНК‑геномом либо односпиральным или двуспиральным РНК‑геномом; для всех форм капсомеров, т. е. белковых субъединиц / протомеров капсид – внешних вирусных оболочек; с учетом вероятностей обнаружения в пробах как непокрытых дополнительной оболочкой [viral envelope] вирусов, так и вирусов с ксеногенным липидным суперкапсидом). Постановка настолько универсализированной задачи противоречит филетическому многообразию молекулярной таксономии вирусов.
Подчеркнем, что размеры вирусов находятся в диапазоне субволновых длин. Поэтому селективные флуоресцентные методы проточной вирометрии также не обладают универсальностью для обнаружения вирусов различных геометрических форм. Это происходит в силу неразличимости оптического сигнала от них (исключения составляют PALM / STORM‑подобные микрофлуориметрические методы).
Надо учесть, что оборудование, которым оснащены современные центры коллективного пользования (core facilities) [12], имеет ограничения. Например, клеточный анализатор (cell analyzer) BD LSRFortessa SORP оптимизирован под размеры лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов. Метод, заложенный в магнитный флуоресцентный счетчик биочастиц autoMACS Pro, препятствует счету одиночных вирусных частиц. Многоцветный проточный цитометр BD FACS Celesta (с комплектацией лазерами на длинах волн 488, 405, 650, 355 и 561 нм) не имеет возможности измерять структуры, порядка размеров вирусных и иных генетических частиц. Надо учитывать помехи из-за паразитных флуоресцентных сигналов, вызванных излучением УФ‑диапазона (подобные эффекты уже наблюдались ранее при работе с УФ‑микроскопами).
Но если вирусы обладают морфологическим различием (in adjecto – различаются геометрическим типом капсида, белковой оболочки вируса), то индикатрисы рассеяния светового потока будут тоже различаться между собой. Когда капсиды вирусов имеют спиральные, икосаэдрические, продолговатые и комплексные формы, это отражается на форме индикатрисы рассеяния. Правда, стоит учитывать, что эти различия могут уверенно наблюдаться только в приборах, прошедших калибровку.
А процедуры калибровки для таких измерительных систем представляют собой отдельный научный вопрос. Для калибровки должны быть выбраны тестовые частицы, адекватные по геометрии и размерам исследуемым вирусам. В идеале они должны обладать автоморфизмом к геометрическим размерам вирусных частиц. Например, быть вирусом той же морфологии, но инактивированного или непатогенного типа, либо быть гомеоморфной к нему. Морфизм, не обеспечивающий взаимно-однозначного соответствия между структурой исследуемого и калибровочного вируса (калибровочной частицы) не вполне достаточен для идентификации. Причина в том, что несоответствие может стать источником появления артефактов в расшифровываемой дифракционной картине (см. рисунок).
Но в методе проточной вирометрии частиц при сохранении идентичных групп симметрии у калибровочных и измеряемых частиц калибровка с их помощью измерительной системы возможна. Хрестоматийный пример: ротавирус, имеющий икосаэдрическую симметрию эффективно аппроксимируется сферическим паттерном в силу большого количества капсомеров (капсомер – повторяющаяся группа молекул структурного белка вириона, образует упорядоченную структуру капсида. Что, переходя на язык фрактальной геометрии, именуется как пертайлинг) [13].
Разработчики сканирующих проточных спектрометров («BioUniScan», Новосибирск) констатируют, что для определения характеристик частиц необходимо решать обратную задачу светорассеяния. Задача нетривиальная даже для случая наблюдения сферических гомогенных частиц субдлинноволнового диапазона. Предварительная калибровка системы является таким же «ноу-хау», как и управляющий алгоритм / протокол измерений.
Общеизвестно, что размеры вирусов в разных таксономических группах отличаются на порядки величин: от 20 до 300 нм. Хотя некоторые представители семейства Filoviridae с одноцепочечной РНК отрицательной полярности имеют длину до 1,4 мкм при поперечнике 0,08 мкм. А у Pandoravirus sp. и Pithovirus sp. уровень компактизации генома, в принципе, физически допускает выход далеко за границы микрометра 1,0–0,5 мкм / 1,5–0,5 мкм соответственно.
Из чего следует качественное различие метрологии и принципов анализа для этих качественно отличных групп. Несмотря на распространенное упрощение, сводимое к экстраполяции интерпретаций теории рассеяния света Ми практически на весь диапазон размеров частиц (включая дифракцию Фраунгофера как частный случай), хорошо известна неправомерность теории Ми при малых параметрах дифракции. Вычислительные возможности, обеспечиваемые теорией Ми, допускают применение одного метода / алгоритма расчетов для аддитивного спектра дисперсности, то есть размеров частиц.
Выскажем гипотезу, что эта экстраполяция в рамках измерений индикатрис световых пучков, прошедших сквозь поток с вирусами, является заблуждением. По факту, получается, что часть пробы с вирусами будет обсчитана неправильно. Поясним это утверждение.
Использовать упрощенные расчеты возможно только в случае, когда речь идет о монодисперсных калибровочных средах, например специальных латексах. Они обладают гомоскедастичностью статистических распределений. Но при рассмотрении сред, в которых содержатся отдельные частицы, различающиеся как по статической геометрии, так и по динамическим морфометрическим параметрам, проявляется гетероскедастичность распределения. Это приводит к неэффективности оценок, так как невозможно заранее знать значения концентрации отдельных частиц и вклад в дифракционную картину дисперсных фракций (или размеров ультраструктурных и микроструктурных единиц биоматериала). В динамике они отличаются от оценок, выполненных как по статической геометрии, так и по динамическим морфометрическим параметрам. Эти критерии в норме реакции являются нестационарным коррелятом общей реактивности протоплазмы / вироплазмы и распространения возбуждения в ней [14, 15]. А квалиметрический весовой критерий в таких задачах вычислить трудно в силу различий геометрий («форм-факторов») частиц.
Говорят, что «если все частицы в пробе больше, чем длина волны света, часть теории Фраунгофера доминирует в теории Ми при расчетах размеров частиц». Но, учитывая анизометрические частицы (к которым относятся и вирусы – те же Filoviridae с невероятным коэффициентом «прозенхимности», как называлось бы это свойство в случае цитометрии клеток растений, по Тахтаджяну: до 1,4 к 0,08), говорить об объективном численном выражении указанного доминирования (особо – без учета ориентации), не приходится в большинстве фактически реализуемых случаев.
Машиннорешаемые абстрактные модели, применимые для вычисления распределений, базируются на допущении о сферической форме частиц. Поэтому распределение частиц по размеру, получаемое в результате анализа, на самом деле является распределением «эквивалентных сферических частиц», а не реальных частиц аналита. (Напомним, что классическая задача электродинамики, решенная в 1908 году Густавом Ми, решается разложением электромагнитного поля на сферические гармоники).
Для вирусов, различающихся по морфологии и генетическому или эволюционному положению, геометрические отклонения от сферы будут различными. Поэтому эффективность эквивалентных измерений будет отличаться для систематически различных вирусов. Говорить об универсальной технологии «функциональной вирометрии» в таком случае невозможно, поскольку размеры номенклатуры даже наиболее распространенных или релевантных для инфекционистов вирусов экстремально варьируют. Следовательно, дифракционные пределы и границы оптимумов применимости того или иного математического подхода, в том числе отличного от теории Ми, варьируются тоже.
А функциональная активность вирулентно-различных форм, как правило, сравнительно слабо коррелирует с усредненной морфологией, вычисляемой в ходе поточной обработки данных с детектора проточного устройства. Даже при принятии допущения, что измерения вирусов ведутся не на дисперсных носителях, а в абстрактной пустой среде с отсутствием адсорбирующих агентов, калибровка измерительной системы будет неэффективна [16].
Если говорить о недостаточности информации для функциональной идентификации, то следует также упомянуть, что теория Ми требует знания коэффициентов преломления и поглощения образца (очевидно, неидентичного для разных потенциальных вирусов) и «дисперсионной среды», которая в нативном случае также характеризуется некоторой неопределенностью, поскольку необходимо анализировать образцы из различных сред.
Очевидно, что в случае анализа нативных сред, возможности окрашивания вирусных частиц (особенно инактивированных), также существенно ограничены. Эта методика используется для окрашивания SyBR green-I [17, 18]; не фиксированных на дисперсных частицах (нанозолота etc.) либо в агарозных иммобилизующих шариках [19]; для экспрессии флуоресцентных белков, не модифицированных генетически, после проникновения в клетку [20, 21].
Особо сложно идентифицировать, анализировать и измерять в естественной среде распространения инфекционные вирусные агенты, которые передаются аэрозольным (воздушно-капельным) путем. К таковым, из наиболее известных, распространенных и легкодифференцируемых заболеваний, обладающих выраженной этиологией, относится существенный пласт инфекций. Его рассмотрение начинается c ОРВИ (Upper Respiratory Tract Infections; URTI), объединяющего в себе респираторно-синцитиальную вирусную инфекцию, риновирусную и аденовирусную инфекции. Продолжают ряд вирусы гриппа / парагриппа, кори, эпидемического паротита, аденовирусной инфекции и т. д.
Определение вирусов без культивации может быть реализовано только в абиогенной среде их распространения. Поэтому для инфекций, передающихся воздушно-капельным (аэрозольным) путем, необходимо внедрение метода, обеспечивающего анализ с захватом частиц в естественной атмосфере.
В то же время, как правило, в физиологических аэрозолях размер капель может существенно превышать сами размеры вирусов. Однако и в стандартной вирометрии известен эффект агрегации вирусов. Поэтому на стандартных проточных цитометрах (FACS) реализуется методика «вирусной агрегометрии». Именно с ее помощью проходит детектирование HSV‑1 и ряда других агрегирующих вирусных частиц с размерами агрегатов выше предела 300–500 нм.
Эти ограничения могут быть преодолены при использовании лазерных аэрозольных спектрометров. Всплеск интереса к аэрозольным и гидрозольным оптическим счетным системам появился в 1970-х годах [22]. Тогда изучались субмикронные частицы жаркой (аридной) зоны и вариации аэрозольных параметров в высокогорных условиях с повышенной инсоляцией и пониженным давлением [23, 24]. Позже, в 1980-е годы, аэрозольные счетчики Жуланова работали на Венере на советских космических аппаратах ВЕГА‑1 и ВЕГА‑2 [25]. С их помощью проводили изучение структуры облачных слоев и размерное распределение аэрозоля венерианской атмосферы [26, 27], изучали механизм возникновения облачных слоев [28].
Диффузионные аэрозольные спектрометры Жуланова с соавторами осуществляют измерение спектра размеров в диапазоне от размера молекулярных кластеров до долей микрона, то есть могут быть оптимизированы для большинства вирометрических задач, не использующих флуоресцентных меток и гранул (beads). Например, модификация 2702 осуществляет мониторинг в диапазоне 3–200 нм, хотя существует возможность расширения верхнего диапазона до N‑микронных масштабов (вплоть до 10 мкм).
Оптические методы вирометрии субмикронного диапазона имеют высокий потенциал в решении задач анализа причин формирования самоорганизующихся вирусных структур или частиц [29, 30], магнитных гибридных «металлорганических» вирусных частиц [31]). Более того, лазерную аэрозольную спектрометрию можно использовать при решении вопросов выживаемости генетического вирусного материала в космических условиях, а также к смежным проблемам космической биологии / астробиологии и т. н. «космического абиогенеза» на базе зольных частиц [32, 33] или вирусно-опосредованной панспермии (либо астрозольного переноса [34, 35]) и иных проблем газофазной экзобиологии [36, 37].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Оптические методы вирометрии субмикронного диапазона могут быть с успехом имплементированы в любых средах, благоприятствующих размножению вирусного материала или препятствующих таковому. И вопросы подбора калибровочных частиц при лазерно-аэрозольно-спектрометрических изысканиях решаются иначе, если использовать принципы динамического светорассеяния.
АВТОРЫ
Градов Олег Валерьевич, с. н. с., Отдел динамики химических и биологических процессов, Институт химической физики им. Семенова, Москва, Россия.Область интересов: микрофлюидика, патч-кламп, ESEM, CLEM, безлинзовая микроскопия, YMD, DIC, SPIM, LSFM, биофизическое приборостроение
ORCID:0000-0001-5118-6261
Жуланов Юрий Васильевич, к. ф.‑ м. н., с. н. с., Научно-исследовательский физико-химический институт им. Л. Я. Карпова, Москва, Россия.
ORCID: 0000-0003-2494-5693
Макавеев Павел Юрьевич, конструктор аэрозольных спектрометров и счетчиков, Научно-исследовательский физико-химический институт им. Л. Я. Карпова, Москва, Россия.
ORCID: 0000-0002-4026-2828
REFERENCES
Maltsev V. P., Chernyshev A. V., Sem’yanov K. A., Soini E. Absolute real-time measurement of particle size distribution with the flying light-scattering indicatrix method. Applied optics. 1996; 35(18): 3275–3280.
Shvalov A. N., Surovtsev I. V., Chernyshev A. V., Soini J. T., Maltsev V. P. Particle classification from light scattering with the scanning flow cytometer. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 1999; 37 (3): 215–220.
Zamora J. L. R., Aguilar H. C. Flow virometry as a tool to study viruses. Methods. 2018; 134: 87–97.
Zicari S., Arakelyan A., Fitzgerald W., Zaitseva E., Chernomordik L. V., Margolis L., Grivel J. C. Evaluation of the maturation of individual Dengue virions with flow virometry. Virology. 2016; 488: 20–27.
Gaudin R., Barteneva N. S. Sorting of small infectious virus particles by flow virometry reveals distinct infectivity profiles. Nature communications. 2015; 6: 6022.
Arakelyan A., Fitzgerald W., Zicari S., Vagida M., Grivel J. C., Margolis L. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of visualized experiments. 2017; 119.
Landowski M., Dabundo J., Liu Q., Nicola A. V., Aguilar H. C. Nipah Virion Entry Kinetics, Composition, and Conformational Changes Determined by Enzymatic VLPs and New Flow Virometry Tools. Journal of virology. 2014; 88(24): 14197–14206.
Bonar M. M., Tilton J. C. High sensitivity detection and sorting of infectious human immunodeficiency virus (HIV‑1) particles by flow virometry. Virology. 2017; 505: 80–90.
DeSantis M. C., Kim J. H., Song H., Klasse P. J., Cheng W. Quantitative correlation between infectivity and Gp120 density on HIV‑1 virions revealed by optical trapping virometry. Journal of Biological Chemistry. 2016; 291(25): 13088–13097.
Arakelyan A., Fitzgerald W., King D., Barreto-de-Souza V., Zicari S., Grivel J.-C., Shattock R., Margolis L. Some HIV‑1 virions are more equal than others: mosaics of envs on individual HIV virions as evaluated with flow virometry. JAIDS Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 2016; 71: 68.
Arakelyan A., Fitzgerald W., King D. F., Rogers P., Cheeseman H. M., Grivel J., Shattock R. J., Margolis L. Flow virometry analysis of envelope glycoprotein conformations on individual HIV virions. Scientific reports. 2017; 7(1): 948.
University of Florida. Center for Immunology & Transplantation. URL: https://immunology.ufl.edu/instrumentation.
Schroeder M. Fractals, chaos, power laws. – Dover, Mineola, 2009. 430 p.
Nasonov D. N. Mestnaya reakciya protoplazmy i rasprostranyayushcheesya vozbuzhdenie. 2 izd. – M.; L.: Izd-vo AN SSSR, 1962.
Насонов Д. Н. Местная реакция протоплазмы и распространяющееся возбуждение. 2 изд. – М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1962.
Отзывы читателей
