eng
Выпуск #8/2024
М. Е. Степанов, А. А. Власов, П. А. Демина, Р. А. Акасов, Г. Бабаева, В. И. Юсупов, Т. В. Егорова, К. Р. Каримуллин, А. Н. Генералова, А. В. Наумов, Е. В. Хайдуков
Интравитальная микроскопия – окно в мир биопроцессов
Интравитальная микроскопия – окно в мир биопроцессов
Просмотры: 1371
DOI: 10.22184/1993-7296.FRos.2024.18.8.640.648
В статье показан потенциал практического использования метода оптической
микроскопии дорсальной кожной складки в качестве эффективной технологии диагностики живых систем.
Экспериментально доказано, что даже в базовой постановке представленный метод
позволяет получать большой объем полезных исследовательских данных в условиях,
максимально приближенных к нативным.
В статье показан потенциал практического использования метода оптической
микроскопии дорсальной кожной складки в качестве эффективной технологии диагностики живых систем.
Экспериментально доказано, что даже в базовой постановке представленный метод
позволяет получать большой объем полезных исследовательских данных в условиях,
максимально приближенных к нативным.
Теги: dark-field fluorescence microscopy life sciences light-field microscopy in white light optical clearing agents науки о жизни оптические просветляющие агенты светлопольная микроскопия в белом свете темнопольная флуоресцентная микроскопия
Интравитальная микроскопия – окно в мир биопроцессов
М. Е. Степанов 1, 2, А. А. Власов 1, П. А. Демина 1, 3, 4, Р. А. Акасов 1, 2, 3, 4, 7, Г. Бабаева 5, В. И. Юсупов 3, 6, Т. В. Егорова 1, 6, К. Р. Каримуллин 1, 6, А. Н. Генералова 3, 4, А. В. Наумов 1, 6, Е. В. Хайдуков 1, 2, 3, 4, 7
Московский педагогический государственный университет, Москва, Россия.
Российский научный центр хирургии им. академика Б. В. Петровского, Москва, Россия.
Курчатовский комплекс кристаллографии и фотоники, НИЦ «Курчатовский институт», Москва, Россия.
Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук, Москва, Россия.
НИИ молекулярной и клеточной медицины, Российский университет дружбы народов, Москва, Россия
Физический институт им. П. Н. Лебедева Российской академии наук, Троицкое обособленное подразделение, Москва, Троицк, Россия.
Российский химико-технологический университет им. Д. И. Менделеева, Москва, Россия
В статье показан потенциал практического использования метода оптической микроскопии дорсальной кожной складки в качестве эффективной технологии диагностики живых систем. Экспериментально доказано, что даже в базовой постановке представленный метод позволяет получать большой объем полезных исследовательских данных в условиях, максимально приближенных к нативным.
Ключевые слова: науки о жизни, оптические просветляющие агенты, светлопольная микроскопия в белом свете, темнопольная флуоресцентная микроскопия
Статья получена: 14.11.2024
Статья принята: 02.12.2024
Введение
В науках о жизни большой объем важной информации может быть получен только при непосредственном изучении живых систем с учетом всех сложных внутренних процессов и взаимодействий. В условиях in vivo, при сохранении межклеточных взаимодействий, транспорта веществ и сигналов можно надеяться на получение реальной картины процессов, протекающих в биологических тканях. Живой организм состоит из триллионов клеток [1], где каждая отдельная клетка является химической фабрикой, синтезирующей и утилизирующей одни вещества и стимулы для того, чтобы производить другие и передавать их дальше по цепочке одному из триллионов адресатов, а может быть, и всем сразу. И все это в абсолютном «молчании», с использованием лишь языка физико-химических «жестов». Тем не менее, изучать эту запутанную систему необходимо и возможно, и главным инструментом здесь оказываются фотоны, с одной стороны, позволяющие регистрировать информацию интуитивно понятным способом, с другой стороны, реализующие достаточное разрешение при анализе живой системы. Методы оптической спектроскопии и микроскопии являются одними из наиболее эффективных способов изучения структуры и динамики сложных молекулярных систем, наноструктур и материалов на их основе [2–9] и широко используются для диагностики и терапии в биологии и медицине [10–14].
Стандартом в области наблюдения является клеточная микроскопия, проводимая in vitro (от лат. «в стекле»), когда клеточный препарат изучается в реальном времени под большим увеличением в искусственно созданных условиях. Однако нетрудно понять, что большая часть информации, связанная с сигналами от других клеток (эндокринными – от далеких клеток, паракринными – от соседних), полностью теряется при таком подходе. Цельную картину взаимного влияния клеток друг на друга можно сохранить, если использовать ex vivo (лат. «из жизни») гистологические подходы, когда анализируется фиксированный тонкий образец ткани, но при этом со всей очевидностью происходит потеря данных о развитии процессов во времени.
Из сказанного ясно, что в современной биологии и медицине чрезвычайно востребованы подходы, обеспечивающие длительный мониторинг живого организма в режиме реального времени на уровне его отдельных клеток и/или систем клеток, что довольно сложно реализовать из-за сильного поглощения излучения оптического диапазона спектра в биологических тканях. Тем не менее, существует ряд методов, позволяющих обойти эту проблему. Например, можно использовать методы просветления [15], когда прозрачность тканей (в основном, покровов) для падающего света повышается благодаря модификации их структурных и оптических свойств путем иммерсии в биосовместимых оптических просветляющих агентах, выравнивающих показатели рассеивателей. Можно поступать иначе и сдвигать излучение в спектральные области, в которых оно слабо взаимодействует с тканями организма, в так называемые спектральные «окна прозрачности» тканей [15, 16], расположенные в ближнем инфракрасном или рентгеновском диапазоне спектра. Наконец, можно обойти проблему специальным выбором геометрии эксперимента – созданием реального окна для наблюдения. Все эти методы, объединенные под общим названием «интравитальная микроскопия» [17] (микроскопия живых систем), сегодня дают возможность достичь значительного прогресса в науках о жизни, поскольку они не нарушают картины сложного межклеточного взаимодействия [18] и обеспечивают наблюдение в реальном времени на уровне отдельных клеток и клеточных структур [19].
В данном обзоре мы демонстрируем пример реализации in vivo метода наблюдения лабораторных мышей с использованием оригинальной конструкции дорсальной кожной складки. В этой конструкции складка кожи на спине животного приподнимается над основной поверхностью тела и фиксируется специальной камерой с оптически прозрачным окном, что дает возможность проводить наблюдения общей продолжительностью до нескольких недель [20]. Показано, что даже в самой базовой конфигурации с использованием инвертированного оптического микроскопа можно наблюдать подкожные слои биологических тканей и кровеносные сосуды (вплоть до капилляров), а также регистрировать процессы, происходящие в них на уровне отдельных клеток в реальном масштабе времени.
1. Методика эксперимента
Схема эксперимента предоставлена на рис. 1. Микроскопические исследования проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Motic AE31E с лампой накаливания в качестве источника белого света и ртутной лампой для визуализации во флюоресцентном режиме. Для дополнительного маркирования биотканей использовали флуоресцентный краситель Cy‑5‑amine с максимумами поглощения (эмиссии) на длинах волн 646 (662) нм. Для возбуждения и детектирования флуоресценции использовали соответствующий набор спектральных фильтров. Для регистрации оптических сигналов использовали камеру Raptor Photonics (digital FALCON EMCCD FA285-CL).
Дорсальная камера и совместимый со стандартным микроскопом столик были спроектированы нами самостоятельно и изготовлены из биосовместимого поликарбоната на 3D-принтере [21]. Ключевым отличием использованной нами дорсальной камеры является минимизированный вес устройства. Хорошо известно, что коммерчески доступные титановые камеры достигают до 30–40% веса животного, что вызывает не только избыточное травмирование животных [22], но и приводит к существенным физиологическим изменениям в процессе наблюдения, например, из-за выработки гормона стресса кортикостерона [23].
Для подготовки к эксперименту дорсальную камеру хирургически устанавливали на спину мыши с фиксацией с помощью нити Монофила 5-0. Все манипуляции с животными проводили с применением общей инъекционной анестезии путем введения комбинации препаратов Золетил-Ксилазин (20–40 мг / кг Ксилазина внутримышечно и 5–10 мг / кг Золетила внутрибрюшинно через 10 минут после Ксилазина). Для уменьшения светорассеяния из исследуемой области удаляли тонкий участок кожи вплоть до мышечной фасции с одной из сторон кожной складки. Микроскопию проводили с использованием набора стандартных микрообъективов 4–40×. Полученные изображения и видео обрабатывали в программе ImageJ.
2. Светлопольная микроскопия в белом свете
Результаты, полученные с использованием методики в светлом поле, иллюстрирует рис. 2. Видно, что методика позволяет наблюдать различные компоненты подкожных тканей: сосудистое русло, а также округлые подкожные жировые клетки (адипоциты). При этом морфология сосудистой сети прослеживается практически до масштаба капилляров: красными метками показано последовательное ветвление крупного сосуда вплоть до терминальных артериол (~15 мкм). Такая детализация дает возможность изучать многие патофизиологические процессы. Например, можно исследовать рост и развитие сосудов (ангиогенез) в ответ на повреждение или химический стимул либо патологическое образование в области дорсального окна. Кроме того, модель дает возможность прямого наблюдения вазодилатации и вазоконстрикции (соответственно, расширения или сужения просвета кровеносных сосудов) при химических или термических воздействиях или воспалениях, что крайне ценно, так как обычно подобные данные изучаются лишь косвенно [24]. Четкая различимость сосудов типа vasa vasorum – тонких сосудов, ответвляющихся напрямую от крупных и питающих их стенки и близлежащие ткани (ответвления отмечены на рис. 2a зеленым цветом), – может быть использована для изучения некоторых распространенных патологий сосудов. Так, нарушения в их работе по одной из гипотез могут быть причиной возникновения воспалений в стенках крупных сосудов и приводить к развитию атеросклероза [25].
Как видно из рис. 2b, оказывается доступной для исследований также и адипозная (жировая) ткань. Это позволяет изучать ее физиологию, а также заболевания, связанные с нарушениями метаболизма, в т. ч. сахарный диабет [26]. Мы подсчитали статистику максимальных диаметров адипоцитов (рис. 2b) и обнаружили, что она соответствует нормальному закону распределения, при этом среднее значение размера элемента адипозной ткани 42 ± 12 мкм.
3. Темнопольная флуоресцентная микроскопия
Флуоресцентная микроскопия в широком поле позволяет существенно расширить круг изучаемых биопроцессов и получить ценные данные в режиме реального времени. Так, уже через несколько секунд после введения флуоресцентного красителя в кровоток малого животного в области дорсальной складки начинают заметно окрашиваться крупные сосуды с максимумом по интенсивности на временных отрезках 3–5 минут. О детализации окрашивания можно судить по рис. 3, где в двух режимах показана одна и та же область дорсального окна при малом увеличении (объектив 4×).
На рис. 3b видно, что на характерном масштабе 20–30 мкм, примерно соответствующем размеру адипоцитов, во флуоресцентном режиме проявляется тонкая сетчатая структура окрашенной капиллярной сети. При большем увеличении (увеличение объектива 40×) возникает возможность наблюдения траекторий движения отдельных компонент крови (рис. 4), непрерывно циркулирующих по артериолам и капиллярам. Так в кадр размером 230 × 230 мкм2 (рис. 4а) попадает одновременно от 20 до 40 индивидуальных клеток крови, движущихся по своим траекториям, то покидая область наблюдения, то вновь возвращаясь в нее. Если взять последовательный набор кадров наблюдения за временной интервал в 30 с и отметить точками в каждом из них регистрируемые клетки, то получится картина движения клеток (рис. 4b). Она отображает статистику регистрации частиц в разных частях кадра. Как показывает видеонаблюдение, этот интервал обеспечивает приблизительно двукратный запас времени на прохождение всего кадра самой медленно двигающейся клеткой. Помимо морфологии сосудистой сети, этот экспресс-анализ дает возможность качественно судить о средней скорости движения клеток: она ниже там, где точки (на рис. 4b) расположены плотнее. Также можно сделать качественные выводы и о наиболее «популярных» траекториях движения: точки расположены реже. Интересно отметить, что даже при расположении в одном сосуде траектории клеток не заполняют его полностью, оставляя пустоты.
Флуоресцентное окрашивание в in vivo эксперименте предоставляет обширные возможности для наблюдений, например, фармакокинетики препаратов, в т. ч. параметров экстравазации из кровотока в ткани [27] и средств доставки лекарств [28], работы клеток иммунной системы [29], микроциркуляции в опухолевых тканях [30].
Заключение
Изучение биологических процессов с помощью света сегодня широко распространено и рутинно используется как в in vitro, так и в ex vivo методиках. Однако как фотография уступает по количеству деталей видеофайлу, а видеозапись уступает реальному зрению, так и обычная микроскопия клеток или тканей содержит лишь малую часть богатой картины биологических процессов. Интравитальная микроскопия позволяет достичь прогресса в преодолении недостатков стандартных методик. Нами была реализована методика исследования в одном из ее базовых вариантов, и в данной работе мы продемонстрировали возможность наблюдения подкожных слоев ткани, в т. ч. сосудов и отдельных клеток крови в режиме реального времени. Тестовые эксперименты показали, что протекающие в биотканях процессы можно регистрировать длительное время вплоть до недели. Оценивая потенциал реализованной методики, мы рассчитываем на широкую кооперацию и внедрение этого многообещающего метода в повседневную исследовательскую практику как для фундаментальных исследований, так и для актуальных практических задач, например, для изучения фармакокинетики существующих и разрабатываемых лекарственных средств, оценки их взаимодействия с клетками организма (в т. ч. иммунными), процессов активной и пассивной доставки лекарственных средств.
Благодарности
Работа выполнена в рамках темы государственного задания Министерства просвещения РФ «Лазерные технологии для биомедицинских приложений» № 122122600055-2 в части проведения оптических наблюдений с помощью метода дорсальной камеры и темы государственного задания НИЦ «Курчатовский институт» в части проведения исследований методами люминесцентной спектроскопии. Разработка конструкции дорсальной камеры и столика выполнена в рамках НИР по контракту № 749-ЭА‑24-НИР от 25.06.2024 г. между Физическим институтом им. П. Н. Лебедева РАН и РНЦХ им. акад. Б. В. Петровского.
REFERENCES
Hu B. C. The human body at cellular resolution: the NIH Human Biomolecular Atlas Program. Nature. 2019; 574(7777):187–92. DOI:10.1038/s41586‑019‑1629‑x.
Naumov A. V. Low-temperature spectroscopy of organic molecules in solid matrices: from the Shpol’skii effect to laser luminescent spectromicroscopy for all effectively emitting single molecules. Phys. Usp. 2013;183(6):633–52. https://doi.org/10.3367/ufne.0183.201306f.0633
Наумов А. В. Спектроскопия органических молекул в твердых матрицах при низких температурах: от эффекта Шпольского к лазерной люминесцентной спектромикроскопии всех эффективно излучающих одиночных молекул. УФН. 2013;183(6):633–52. https://doi.org/10.3367/UFNr.0183.201306f.0633.
Eremchev I. Y., Lozing N. A., Baev A. A., Tarasevich A. O., Gladush M. G., Rozhentsov A. A. et al. Luminescence Microscopy of Single Quantum Dot Pairs with Nanometer Spatial Resolution. JETP Letters. 2018;108(1):30–37. https://doi.org/10.1134/S0021364018130076
Еремчев И. Ю., Лозинг Н. А., Баев А. А., Тарасевич А. О., Гладуш М. Г., Роженцов А. А. и др. Люминесцентная микроскопия одиночных пар квантовых точек с нанометровым пространственным разрешением. Письма в ЖЭТФ. 2018;108(1):26–34. https://doi.org/10.1134/S0370274X18130064.
Naumov A. V., Gorshelev A. A., Gladush M. G., Anikushina T. A., Golovanova A. V., Köhler J., Kador L. Micro–Refractometry and Local–Field Mapping with Single Molecules. Nano Letters. 2018:18(10)6129–34. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.8b01753.
Karimullin K. R., Arzhanov A. I., Eremchev I. Y., Kulnitskiy B. A., Surovtsev N. V., Naumov A. V. Combined photon–echo, luminescence and Raman spectroscopies of layered ensembles of colloidal quantum dots. Laser Physics. 2019;29(12). https://doi.org/10.1088/1555–6611/ab4bdb.
Karimullin K. R., Arzhanov A. I., Surovtsev N. V., Naumov A. V. Electron–Phonon Interaction in Composites with Colloidal Quantum Dots: A Study by Luminescence Spectroscopy and Raman Scattering. Optics and Spectroscopy. 2023;131(10)995–999. https://doi.org/10.1134/S0030400X2310010
Каримуллин К. Р., Аржанов А. И., Суровцев Н. В., Наумов А. В. Электрон-фононное взаимодействие в композитах с коллоидными квантовыми точками: исследование методами люминесцентной спектроскопии и комбинационного рассеяния света. Оптика и спектроскопия. 2022;130(1):146–150. https://doi.org/10.21883/os.2022.01.51902.42–21.
Eskova A. E., Arzhanov A. I., Magaryan K. A., Karimullin K. R., Naumov A. V. Effect of Concentration on the Spectral–Luminescent Properties of Quantum Dots in Colloidal Solutions. Bulletin of the Russian Academy of Sciences: Physics. 2020;84(1):40–3. https://doi.org/10.3103/S1062873820010116).
Еськова А. Е., Аржанов А. И., Магарян К. А., Каримуллин К. Р., Наумов А. В. Исследование влияния концентрации квантовых точек в коллоидном растворе на его спектрально–люминесцентные свойства. Известия РАН. Серия физическая. 2020;84(1):48–51. https://doi.org/10.31857/S036767652001012
Arzhanov A. I., Savostianov A. O., Magaryan K. A., Karimullin K. R., Naumov A. V. Photonics of semiconductor quantum dots: Applied aspects. Photonics Russia. 2022;16(2): 96–113. https://doi.org/10.22184/1993‑7296.FRos.2022.16.2.96.112
Аржанов А. И., Савостьянов А. О., Магарян К. А., Каримуллин К. Р., Наумов А. В. Фотоника полупроводниковых квантовых точек: прикладные аспекты. Фотоника. 2022;16(2): 96–113. https://doi.org/10.22184/1993‑7296.FRos.2022.16.2.96.112
Generalova A. N., Demina P. A., Akasov R. A., Khaydukov K. V. Photopolymerization in 3D printing of tissue–engineered constructs for regenerative medicine. Russian Chemical Reviews. 2023;92(2): RCR5068. https://doi.org/10.57634/RCR5068
Генералова А. Н., Демина П. А., Акасов Р. А., Хайдуков Е. В. Фотополимеризация в 3D–печати тканеинженерных конструкций для регенеративной медицины. Успехи химии. 2023;92(2): RCR5068. https://doi.org/10.57634/RCR5068
Demina P. A., Khaydukov K. V., Rocheva V. V., Akasov R. A., Generalova A. N., Khaydukov E. V. Technology of Infrared Photopolymerization. 2022. Photonica Russia. 2022;16(8)600–2. https://doi.org/10.22184/1993‑7296.FRos.2022.16.8.600.602.
Демина П. А., Хайдуков К. В., Рочева В. В., Акасов Р. А., Генералова А. Н., Хайдуков Е. В. Технология инфракрасной фотополимеризации. Фотоника. 2022;16(8)600–2. https://doi.org/10.22184/1993‑7296.FRos.2022.16.8.600.602.
Bugay A. N. Biological Action of Intense Laser Pulses at the Molecular Level. Bulletin of the Russian Academy of Sciences: Physics. 2024;88(6)842–6. https://doi.org/10.1134/S1062873824706718.
Leontyev A. V., Nurtdinova L. A., Mityushkin E. O., Shmelev A. G., Zharkov D. K., Andrianov V. V., Muranova L. N., Gainutdinov Kh.L., Nikiforov V. G. Testing Nanosensors Based on NaYF4: Yb, Er for Measuring Temperature in Biological Media. Bulletin of the Russian Academy of Sciences: Physics. 2024;88(6):853–8. https://doi.org/10.1134/S1062873824706731.
Eremchev M. Yu. Second Harmonic Generation as a Noninvasive Method to Study Molecular Processes on the Surface of Lipid Membranes (Brief Review). JETP Letters. 2023;118(4):288–95. https://doi.org/10.1134/S0021364023602245.
Еремчев М. Ю. Генерация второй гармоники как неинвазивный метод исследования молекулярных процессов на поверхности липидных мембран (миниобзор). Письма в ЖЭТФ. 2023;118(4):282–90. https://doi.org/10.31857/S1234567823160103
Starodubtsev N. F., Denisenko V. I., Karimullin K. R., Kurdoglian M. S., Lysenko S. A., Naumov A. V., Tagabilev D. G., Yuryshev N. N. Theoretical substantiation of the thermal mechanism of local oxygenation of biological tissue under the action of low-intensity near-infrared radiation. Medical physics. 2023;4:78–83. https://doi.org/10.52775/1810‑200X‑2023‑99‑100‑4‑78‑83.
Стародубцев Н. Ф., Денисенко В. И., Каримуллин К. Р., Курдоглян М. С., Лысенко С. А., Наумов А. В., Тагабилев Д. Г., Юрышев Н. Н. Теоретическое обоснование теплового механизма локальной оксигенации биологической ткани под действием низкоинтенсивного излучения ближнего ИК диапазона. Медицинская физика. 2023;4:78–83. https://doi.org/10.52775/1810‑200X‑2023‑99‑100‑4‑78‑83.
Turchin I. V. Methods of biomedical optical imaging: from subcellular structures to tissues and organs. Phys. Usp. 2016;59(5):487–501. https://doi.org/10.3367/UFNe.2015.12.037734.
Турчин И. В. Методы оптической биомедицинской визуализации: от субклеточных структур до тканей и органов. Успехи физических наук. 2016;186(5):550–67. https://doi.org/10.3367/UFNr.2015.12.037734
Smith A. M., Mancini M. C., Nie S. Bioimaging: second window for in vivo imaging. Nature Nanotechnology. 2009;4(11):710–1. https://doi.org/10.1038/nnano.2009.326.
Coste A., Oktay M. H., Condeelis J. S., Entenberg D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. 2020;97(5)448–57. https://doi.org/10.1002/cyto.a.23963.
Kienle K., Lammermann T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunol Review. 2016;273(1):76–93. https://doi.org/10.1111/imr.12458.
Jing Y., Zhang C., Yu B., Lin D., Qu J. Super–Resolution Microscopy: Shedding New Light on In Vivo Imaging. Frontiers in Chemistry. 2021;9:746900. https://doi.org/10.3389/fchem.2021.746900.
Laschke M. W., Menger M. D. The dorsal skinfold chamber: A versatile tool for preclinical research in tissue engineering and regenerative medicine. European Cells & Materials. 2016;32:202–15. https://doi.org/10.22203/eCM.v032a13.
Stepanov M. E., Vlasov A. A., Vinokurov I. A., Tagabilev D. G., Kotenko K. V., Khaydukov E. V., Naumov A. V., Yusupov V. I. Device for fixing a small laboratory animal with a dorsal camera installed during microscopic examination. Application for the invention of the Russian Federation. 2024. No. 2024127009.
Степанов М. Е., Власов А. А., Винокуров И. А., Тагабилев Д. Г., Котенко К. В., Хайдуков Е. В., Наумов А. В., Юсупов В. И. Устройство для фиксации мелкого лабораторного животного с установленной дорсальной камерой при проведении микроскопического исследования. Заявка на изобретение РФ. 2024. № 2024127009.
Xie W., Lorenz M., Poosch F., Palme R., Zechner D., Vollmar B., Grambow E., Struder D. 3D–printed lightweight dorsal skin fold chambers from PEEK reduce chamber–related animal distress. Scientific Reports. 2022;12(1):11599. https://doi.org/10.1038/s41598‑022‑13924‑5.
Sckell A., Leunig M. The Dorsal Skinfold Chamber: Studying Angiogenesis by Intravital Microscopy. In: Murray C., Martin S. (eds) Angiogenesis Protocols. Methods in Molecular Biology. 2009;467:305–17. https://doi.org/10.1007/978‑1‑59745‑241‑0_19.
Johnson J. M., Kellogg D. L. Jr. Local thermal control of the human cutaneous circulation. Journal of Applied Physiology. 2010;109(4):1229–38. https://doi.org/10.1152/japplphysiol.00407.2010.
Jarvilehto M., Tuohimaa P. Vasa vasorum hypoxia: initiation of atherosclerosis. Medical Hypotheses. 2009;73(1):40–1. https://doi.org/10.1016/j.mehy.2008.11.046.
Kuhel D. G., Konaniah E. S., Basford J. E., McVey C., Goodin C. T., Chatterjee T. K., Weintraub N. L., Hui D. Y. Apolipoprotein E2 accentuates postprandial inflammation and diet–induced obesity to promote hyperinsulinemia in mice. Diabetes. 2013;62(2):382–91. https://doi.org/10.2337/db12‑0390.
Honkura N., Richards M., Lavina B., Sainz–Jaspeado M., Betsholtz C., Claesson–Welsh L. Intravital imaging–based analysis tools for vessel identification and assessment of concurrent dynamic vascular events. Nature Communications. 2018;9(1):2746. https://doi.org/10.1038/s41467‑018‑04929‑8.
Giampetraglia M., Weigelin B. Recent advances in intravital microscopy for preclinical research. Current Opinion in Chemical Biology. 2021;63:200–8. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2021.05.010.
Ishii M. Intravital imaging technology reveals immune system dynamics in vivo. Allergology International. 2016;65(3):225–7. https://doi.org/ 10.1016/j.alit.2016.05.001.
Lin Q., Choyke P. L., Sato N. Visualizing vasculature and its response to therapy in the tumor microenvironment. Theranostics. 2023;13(15):5223–46. https://doi.org/10.7150/thno.84947.
М. Е. Степанов 1, 2, А. А. Власов 1, П. А. Демина 1, 3, 4, Р. А. Акасов 1, 2, 3, 4, 7, Г. Бабаева 5, В. И. Юсупов 3, 6, Т. В. Егорова 1, 6, К. Р. Каримуллин 1, 6, А. Н. Генералова 3, 4, А. В. Наумов 1, 6, Е. В. Хайдуков 1, 2, 3, 4, 7
Московский педагогический государственный университет, Москва, Россия.
Российский научный центр хирургии им. академика Б. В. Петровского, Москва, Россия.
Курчатовский комплекс кристаллографии и фотоники, НИЦ «Курчатовский институт», Москва, Россия.
Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук, Москва, Россия.
НИИ молекулярной и клеточной медицины, Российский университет дружбы народов, Москва, Россия
Физический институт им. П. Н. Лебедева Российской академии наук, Троицкое обособленное подразделение, Москва, Троицк, Россия.
Российский химико-технологический университет им. Д. И. Менделеева, Москва, Россия
В статье показан потенциал практического использования метода оптической микроскопии дорсальной кожной складки в качестве эффективной технологии диагностики живых систем. Экспериментально доказано, что даже в базовой постановке представленный метод позволяет получать большой объем полезных исследовательских данных в условиях, максимально приближенных к нативным.
Ключевые слова: науки о жизни, оптические просветляющие агенты, светлопольная микроскопия в белом свете, темнопольная флуоресцентная микроскопия
Статья получена: 14.11.2024
Статья принята: 02.12.2024
Введение
В науках о жизни большой объем важной информации может быть получен только при непосредственном изучении живых систем с учетом всех сложных внутренних процессов и взаимодействий. В условиях in vivo, при сохранении межклеточных взаимодействий, транспорта веществ и сигналов можно надеяться на получение реальной картины процессов, протекающих в биологических тканях. Живой организм состоит из триллионов клеток [1], где каждая отдельная клетка является химической фабрикой, синтезирующей и утилизирующей одни вещества и стимулы для того, чтобы производить другие и передавать их дальше по цепочке одному из триллионов адресатов, а может быть, и всем сразу. И все это в абсолютном «молчании», с использованием лишь языка физико-химических «жестов». Тем не менее, изучать эту запутанную систему необходимо и возможно, и главным инструментом здесь оказываются фотоны, с одной стороны, позволяющие регистрировать информацию интуитивно понятным способом, с другой стороны, реализующие достаточное разрешение при анализе живой системы. Методы оптической спектроскопии и микроскопии являются одними из наиболее эффективных способов изучения структуры и динамики сложных молекулярных систем, наноструктур и материалов на их основе [2–9] и широко используются для диагностики и терапии в биологии и медицине [10–14].
Стандартом в области наблюдения является клеточная микроскопия, проводимая in vitro (от лат. «в стекле»), когда клеточный препарат изучается в реальном времени под большим увеличением в искусственно созданных условиях. Однако нетрудно понять, что большая часть информации, связанная с сигналами от других клеток (эндокринными – от далеких клеток, паракринными – от соседних), полностью теряется при таком подходе. Цельную картину взаимного влияния клеток друг на друга можно сохранить, если использовать ex vivo (лат. «из жизни») гистологические подходы, когда анализируется фиксированный тонкий образец ткани, но при этом со всей очевидностью происходит потеря данных о развитии процессов во времени.
Из сказанного ясно, что в современной биологии и медицине чрезвычайно востребованы подходы, обеспечивающие длительный мониторинг живого организма в режиме реального времени на уровне его отдельных клеток и/или систем клеток, что довольно сложно реализовать из-за сильного поглощения излучения оптического диапазона спектра в биологических тканях. Тем не менее, существует ряд методов, позволяющих обойти эту проблему. Например, можно использовать методы просветления [15], когда прозрачность тканей (в основном, покровов) для падающего света повышается благодаря модификации их структурных и оптических свойств путем иммерсии в биосовместимых оптических просветляющих агентах, выравнивающих показатели рассеивателей. Можно поступать иначе и сдвигать излучение в спектральные области, в которых оно слабо взаимодействует с тканями организма, в так называемые спектральные «окна прозрачности» тканей [15, 16], расположенные в ближнем инфракрасном или рентгеновском диапазоне спектра. Наконец, можно обойти проблему специальным выбором геометрии эксперимента – созданием реального окна для наблюдения. Все эти методы, объединенные под общим названием «интравитальная микроскопия» [17] (микроскопия живых систем), сегодня дают возможность достичь значительного прогресса в науках о жизни, поскольку они не нарушают картины сложного межклеточного взаимодействия [18] и обеспечивают наблюдение в реальном времени на уровне отдельных клеток и клеточных структур [19].
В данном обзоре мы демонстрируем пример реализации in vivo метода наблюдения лабораторных мышей с использованием оригинальной конструкции дорсальной кожной складки. В этой конструкции складка кожи на спине животного приподнимается над основной поверхностью тела и фиксируется специальной камерой с оптически прозрачным окном, что дает возможность проводить наблюдения общей продолжительностью до нескольких недель [20]. Показано, что даже в самой базовой конфигурации с использованием инвертированного оптического микроскопа можно наблюдать подкожные слои биологических тканей и кровеносные сосуды (вплоть до капилляров), а также регистрировать процессы, происходящие в них на уровне отдельных клеток в реальном масштабе времени.
1. Методика эксперимента
Схема эксперимента предоставлена на рис. 1. Микроскопические исследования проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Motic AE31E с лампой накаливания в качестве источника белого света и ртутной лампой для визуализации во флюоресцентном режиме. Для дополнительного маркирования биотканей использовали флуоресцентный краситель Cy‑5‑amine с максимумами поглощения (эмиссии) на длинах волн 646 (662) нм. Для возбуждения и детектирования флуоресценции использовали соответствующий набор спектральных фильтров. Для регистрации оптических сигналов использовали камеру Raptor Photonics (digital FALCON EMCCD FA285-CL).
Дорсальная камера и совместимый со стандартным микроскопом столик были спроектированы нами самостоятельно и изготовлены из биосовместимого поликарбоната на 3D-принтере [21]. Ключевым отличием использованной нами дорсальной камеры является минимизированный вес устройства. Хорошо известно, что коммерчески доступные титановые камеры достигают до 30–40% веса животного, что вызывает не только избыточное травмирование животных [22], но и приводит к существенным физиологическим изменениям в процессе наблюдения, например, из-за выработки гормона стресса кортикостерона [23].
Для подготовки к эксперименту дорсальную камеру хирургически устанавливали на спину мыши с фиксацией с помощью нити Монофила 5-0. Все манипуляции с животными проводили с применением общей инъекционной анестезии путем введения комбинации препаратов Золетил-Ксилазин (20–40 мг / кг Ксилазина внутримышечно и 5–10 мг / кг Золетила внутрибрюшинно через 10 минут после Ксилазина). Для уменьшения светорассеяния из исследуемой области удаляли тонкий участок кожи вплоть до мышечной фасции с одной из сторон кожной складки. Микроскопию проводили с использованием набора стандартных микрообъективов 4–40×. Полученные изображения и видео обрабатывали в программе ImageJ.
2. Светлопольная микроскопия в белом свете
Результаты, полученные с использованием методики в светлом поле, иллюстрирует рис. 2. Видно, что методика позволяет наблюдать различные компоненты подкожных тканей: сосудистое русло, а также округлые подкожные жировые клетки (адипоциты). При этом морфология сосудистой сети прослеживается практически до масштаба капилляров: красными метками показано последовательное ветвление крупного сосуда вплоть до терминальных артериол (~15 мкм). Такая детализация дает возможность изучать многие патофизиологические процессы. Например, можно исследовать рост и развитие сосудов (ангиогенез) в ответ на повреждение или химический стимул либо патологическое образование в области дорсального окна. Кроме того, модель дает возможность прямого наблюдения вазодилатации и вазоконстрикции (соответственно, расширения или сужения просвета кровеносных сосудов) при химических или термических воздействиях или воспалениях, что крайне ценно, так как обычно подобные данные изучаются лишь косвенно [24]. Четкая различимость сосудов типа vasa vasorum – тонких сосудов, ответвляющихся напрямую от крупных и питающих их стенки и близлежащие ткани (ответвления отмечены на рис. 2a зеленым цветом), – может быть использована для изучения некоторых распространенных патологий сосудов. Так, нарушения в их работе по одной из гипотез могут быть причиной возникновения воспалений в стенках крупных сосудов и приводить к развитию атеросклероза [25].
Как видно из рис. 2b, оказывается доступной для исследований также и адипозная (жировая) ткань. Это позволяет изучать ее физиологию, а также заболевания, связанные с нарушениями метаболизма, в т. ч. сахарный диабет [26]. Мы подсчитали статистику максимальных диаметров адипоцитов (рис. 2b) и обнаружили, что она соответствует нормальному закону распределения, при этом среднее значение размера элемента адипозной ткани 42 ± 12 мкм.
3. Темнопольная флуоресцентная микроскопия
Флуоресцентная микроскопия в широком поле позволяет существенно расширить круг изучаемых биопроцессов и получить ценные данные в режиме реального времени. Так, уже через несколько секунд после введения флуоресцентного красителя в кровоток малого животного в области дорсальной складки начинают заметно окрашиваться крупные сосуды с максимумом по интенсивности на временных отрезках 3–5 минут. О детализации окрашивания можно судить по рис. 3, где в двух режимах показана одна и та же область дорсального окна при малом увеличении (объектив 4×).
На рис. 3b видно, что на характерном масштабе 20–30 мкм, примерно соответствующем размеру адипоцитов, во флуоресцентном режиме проявляется тонкая сетчатая структура окрашенной капиллярной сети. При большем увеличении (увеличение объектива 40×) возникает возможность наблюдения траекторий движения отдельных компонент крови (рис. 4), непрерывно циркулирующих по артериолам и капиллярам. Так в кадр размером 230 × 230 мкм2 (рис. 4а) попадает одновременно от 20 до 40 индивидуальных клеток крови, движущихся по своим траекториям, то покидая область наблюдения, то вновь возвращаясь в нее. Если взять последовательный набор кадров наблюдения за временной интервал в 30 с и отметить точками в каждом из них регистрируемые клетки, то получится картина движения клеток (рис. 4b). Она отображает статистику регистрации частиц в разных частях кадра. Как показывает видеонаблюдение, этот интервал обеспечивает приблизительно двукратный запас времени на прохождение всего кадра самой медленно двигающейся клеткой. Помимо морфологии сосудистой сети, этот экспресс-анализ дает возможность качественно судить о средней скорости движения клеток: она ниже там, где точки (на рис. 4b) расположены плотнее. Также можно сделать качественные выводы и о наиболее «популярных» траекториях движения: точки расположены реже. Интересно отметить, что даже при расположении в одном сосуде траектории клеток не заполняют его полностью, оставляя пустоты.
Флуоресцентное окрашивание в in vivo эксперименте предоставляет обширные возможности для наблюдений, например, фармакокинетики препаратов, в т. ч. параметров экстравазации из кровотока в ткани [27] и средств доставки лекарств [28], работы клеток иммунной системы [29], микроциркуляции в опухолевых тканях [30].
Заключение
Изучение биологических процессов с помощью света сегодня широко распространено и рутинно используется как в in vitro, так и в ex vivo методиках. Однако как фотография уступает по количеству деталей видеофайлу, а видеозапись уступает реальному зрению, так и обычная микроскопия клеток или тканей содержит лишь малую часть богатой картины биологических процессов. Интравитальная микроскопия позволяет достичь прогресса в преодолении недостатков стандартных методик. Нами была реализована методика исследования в одном из ее базовых вариантов, и в данной работе мы продемонстрировали возможность наблюдения подкожных слоев ткани, в т. ч. сосудов и отдельных клеток крови в режиме реального времени. Тестовые эксперименты показали, что протекающие в биотканях процессы можно регистрировать длительное время вплоть до недели. Оценивая потенциал реализованной методики, мы рассчитываем на широкую кооперацию и внедрение этого многообещающего метода в повседневную исследовательскую практику как для фундаментальных исследований, так и для актуальных практических задач, например, для изучения фармакокинетики существующих и разрабатываемых лекарственных средств, оценки их взаимодействия с клетками организма (в т. ч. иммунными), процессов активной и пассивной доставки лекарственных средств.
Благодарности
Работа выполнена в рамках темы государственного задания Министерства просвещения РФ «Лазерные технологии для биомедицинских приложений» № 122122600055-2 в части проведения оптических наблюдений с помощью метода дорсальной камеры и темы государственного задания НИЦ «Курчатовский институт» в части проведения исследований методами люминесцентной спектроскопии. Разработка конструкции дорсальной камеры и столика выполнена в рамках НИР по контракту № 749-ЭА‑24-НИР от 25.06.2024 г. между Физическим институтом им. П. Н. Лебедева РАН и РНЦХ им. акад. Б. В. Петровского.
REFERENCES
Hu B. C. The human body at cellular resolution: the NIH Human Biomolecular Atlas Program. Nature. 2019; 574(7777):187–92. DOI:10.1038/s41586‑019‑1629‑x.
Naumov A. V. Low-temperature spectroscopy of organic molecules in solid matrices: from the Shpol’skii effect to laser luminescent spectromicroscopy for all effectively emitting single molecules. Phys. Usp. 2013;183(6):633–52. https://doi.org/10.3367/ufne.0183.201306f.0633
Наумов А. В. Спектроскопия органических молекул в твердых матрицах при низких температурах: от эффекта Шпольского к лазерной люминесцентной спектромикроскопии всех эффективно излучающих одиночных молекул. УФН. 2013;183(6):633–52. https://doi.org/10.3367/UFNr.0183.201306f.0633.
Eremchev I. Y., Lozing N. A., Baev A. A., Tarasevich A. O., Gladush M. G., Rozhentsov A. A. et al. Luminescence Microscopy of Single Quantum Dot Pairs with Nanometer Spatial Resolution. JETP Letters. 2018;108(1):30–37. https://doi.org/10.1134/S0021364018130076
Еремчев И. Ю., Лозинг Н. А., Баев А. А., Тарасевич А. О., Гладуш М. Г., Роженцов А. А. и др. Люминесцентная микроскопия одиночных пар квантовых точек с нанометровым пространственным разрешением. Письма в ЖЭТФ. 2018;108(1):26–34. https://doi.org/10.1134/S0370274X18130064.
Naumov A. V., Gorshelev A. A., Gladush M. G., Anikushina T. A., Golovanova A. V., Köhler J., Kador L. Micro–Refractometry and Local–Field Mapping with Single Molecules. Nano Letters. 2018:18(10)6129–34. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.8b01753.
Karimullin K. R., Arzhanov A. I., Eremchev I. Y., Kulnitskiy B. A., Surovtsev N. V., Naumov A. V. Combined photon–echo, luminescence and Raman spectroscopies of layered ensembles of colloidal quantum dots. Laser Physics. 2019;29(12). https://doi.org/10.1088/1555–6611/ab4bdb.
Karimullin K. R., Arzhanov A. I., Surovtsev N. V., Naumov A. V. Electron–Phonon Interaction in Composites with Colloidal Quantum Dots: A Study by Luminescence Spectroscopy and Raman Scattering. Optics and Spectroscopy. 2023;131(10)995–999. https://doi.org/10.1134/S0030400X2310010
Каримуллин К. Р., Аржанов А. И., Суровцев Н. В., Наумов А. В. Электрон-фононное взаимодействие в композитах с коллоидными квантовыми точками: исследование методами люминесцентной спектроскопии и комбинационного рассеяния света. Оптика и спектроскопия. 2022;130(1):146–150. https://doi.org/10.21883/os.2022.01.51902.42–21.
Eskova A. E., Arzhanov A. I., Magaryan K. A., Karimullin K. R., Naumov A. V. Effect of Concentration on the Spectral–Luminescent Properties of Quantum Dots in Colloidal Solutions. Bulletin of the Russian Academy of Sciences: Physics. 2020;84(1):40–3. https://doi.org/10.3103/S1062873820010116).
Еськова А. Е., Аржанов А. И., Магарян К. А., Каримуллин К. Р., Наумов А. В. Исследование влияния концентрации квантовых точек в коллоидном растворе на его спектрально–люминесцентные свойства. Известия РАН. Серия физическая. 2020;84(1):48–51. https://doi.org/10.31857/S036767652001012
Arzhanov A. I., Savostianov A. O., Magaryan K. A., Karimullin K. R., Naumov A. V. Photonics of semiconductor quantum dots: Applied aspects. Photonics Russia. 2022;16(2): 96–113. https://doi.org/10.22184/1993‑7296.FRos.2022.16.2.96.112
Аржанов А. И., Савостьянов А. О., Магарян К. А., Каримуллин К. Р., Наумов А. В. Фотоника полупроводниковых квантовых точек: прикладные аспекты. Фотоника. 2022;16(2): 96–113. https://doi.org/10.22184/1993‑7296.FRos.2022.16.2.96.112
Generalova A. N., Demina P. A., Akasov R. A., Khaydukov K. V. Photopolymerization in 3D printing of tissue–engineered constructs for regenerative medicine. Russian Chemical Reviews. 2023;92(2): RCR5068. https://doi.org/10.57634/RCR5068
Генералова А. Н., Демина П. А., Акасов Р. А., Хайдуков Е. В. Фотополимеризация в 3D–печати тканеинженерных конструкций для регенеративной медицины. Успехи химии. 2023;92(2): RCR5068. https://doi.org/10.57634/RCR5068
Demina P. A., Khaydukov K. V., Rocheva V. V., Akasov R. A., Generalova A. N., Khaydukov E. V. Technology of Infrared Photopolymerization. 2022. Photonica Russia. 2022;16(8)600–2. https://doi.org/10.22184/1993‑7296.FRos.2022.16.8.600.602.
Демина П. А., Хайдуков К. В., Рочева В. В., Акасов Р. А., Генералова А. Н., Хайдуков Е. В. Технология инфракрасной фотополимеризации. Фотоника. 2022;16(8)600–2. https://doi.org/10.22184/1993‑7296.FRos.2022.16.8.600.602.
Bugay A. N. Biological Action of Intense Laser Pulses at the Molecular Level. Bulletin of the Russian Academy of Sciences: Physics. 2024;88(6)842–6. https://doi.org/10.1134/S1062873824706718.
Leontyev A. V., Nurtdinova L. A., Mityushkin E. O., Shmelev A. G., Zharkov D. K., Andrianov V. V., Muranova L. N., Gainutdinov Kh.L., Nikiforov V. G. Testing Nanosensors Based on NaYF4: Yb, Er for Measuring Temperature in Biological Media. Bulletin of the Russian Academy of Sciences: Physics. 2024;88(6):853–8. https://doi.org/10.1134/S1062873824706731.
Eremchev M. Yu. Second Harmonic Generation as a Noninvasive Method to Study Molecular Processes on the Surface of Lipid Membranes (Brief Review). JETP Letters. 2023;118(4):288–95. https://doi.org/10.1134/S0021364023602245.
Еремчев М. Ю. Генерация второй гармоники как неинвазивный метод исследования молекулярных процессов на поверхности липидных мембран (миниобзор). Письма в ЖЭТФ. 2023;118(4):282–90. https://doi.org/10.31857/S1234567823160103
Starodubtsev N. F., Denisenko V. I., Karimullin K. R., Kurdoglian M. S., Lysenko S. A., Naumov A. V., Tagabilev D. G., Yuryshev N. N. Theoretical substantiation of the thermal mechanism of local oxygenation of biological tissue under the action of low-intensity near-infrared radiation. Medical physics. 2023;4:78–83. https://doi.org/10.52775/1810‑200X‑2023‑99‑100‑4‑78‑83.
Стародубцев Н. Ф., Денисенко В. И., Каримуллин К. Р., Курдоглян М. С., Лысенко С. А., Наумов А. В., Тагабилев Д. Г., Юрышев Н. Н. Теоретическое обоснование теплового механизма локальной оксигенации биологической ткани под действием низкоинтенсивного излучения ближнего ИК диапазона. Медицинская физика. 2023;4:78–83. https://doi.org/10.52775/1810‑200X‑2023‑99‑100‑4‑78‑83.
Turchin I. V. Methods of biomedical optical imaging: from subcellular structures to tissues and organs. Phys. Usp. 2016;59(5):487–501. https://doi.org/10.3367/UFNe.2015.12.037734.
Турчин И. В. Методы оптической биомедицинской визуализации: от субклеточных структур до тканей и органов. Успехи физических наук. 2016;186(5):550–67. https://doi.org/10.3367/UFNr.2015.12.037734
Smith A. M., Mancini M. C., Nie S. Bioimaging: second window for in vivo imaging. Nature Nanotechnology. 2009;4(11):710–1. https://doi.org/10.1038/nnano.2009.326.
Coste A., Oktay M. H., Condeelis J. S., Entenberg D. Intravital Imaging Techniques for Biomedical and Clinical Research. Cytometry A. 2020;97(5)448–57. https://doi.org/10.1002/cyto.a.23963.
Kienle K., Lammermann T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunol Review. 2016;273(1):76–93. https://doi.org/10.1111/imr.12458.
Jing Y., Zhang C., Yu B., Lin D., Qu J. Super–Resolution Microscopy: Shedding New Light on In Vivo Imaging. Frontiers in Chemistry. 2021;9:746900. https://doi.org/10.3389/fchem.2021.746900.
Laschke M. W., Menger M. D. The dorsal skinfold chamber: A versatile tool for preclinical research in tissue engineering and regenerative medicine. European Cells & Materials. 2016;32:202–15. https://doi.org/10.22203/eCM.v032a13.
Stepanov M. E., Vlasov A. A., Vinokurov I. A., Tagabilev D. G., Kotenko K. V., Khaydukov E. V., Naumov A. V., Yusupov V. I. Device for fixing a small laboratory animal with a dorsal camera installed during microscopic examination. Application for the invention of the Russian Federation. 2024. No. 2024127009.
Степанов М. Е., Власов А. А., Винокуров И. А., Тагабилев Д. Г., Котенко К. В., Хайдуков Е. В., Наумов А. В., Юсупов В. И. Устройство для фиксации мелкого лабораторного животного с установленной дорсальной камерой при проведении микроскопического исследования. Заявка на изобретение РФ. 2024. № 2024127009.
Xie W., Lorenz M., Poosch F., Palme R., Zechner D., Vollmar B., Grambow E., Struder D. 3D–printed lightweight dorsal skin fold chambers from PEEK reduce chamber–related animal distress. Scientific Reports. 2022;12(1):11599. https://doi.org/10.1038/s41598‑022‑13924‑5.
Sckell A., Leunig M. The Dorsal Skinfold Chamber: Studying Angiogenesis by Intravital Microscopy. In: Murray C., Martin S. (eds) Angiogenesis Protocols. Methods in Molecular Biology. 2009;467:305–17. https://doi.org/10.1007/978‑1‑59745‑241‑0_19.
Johnson J. M., Kellogg D. L. Jr. Local thermal control of the human cutaneous circulation. Journal of Applied Physiology. 2010;109(4):1229–38. https://doi.org/10.1152/japplphysiol.00407.2010.
Jarvilehto M., Tuohimaa P. Vasa vasorum hypoxia: initiation of atherosclerosis. Medical Hypotheses. 2009;73(1):40–1. https://doi.org/10.1016/j.mehy.2008.11.046.
Kuhel D. G., Konaniah E. S., Basford J. E., McVey C., Goodin C. T., Chatterjee T. K., Weintraub N. L., Hui D. Y. Apolipoprotein E2 accentuates postprandial inflammation and diet–induced obesity to promote hyperinsulinemia in mice. Diabetes. 2013;62(2):382–91. https://doi.org/10.2337/db12‑0390.
Honkura N., Richards M., Lavina B., Sainz–Jaspeado M., Betsholtz C., Claesson–Welsh L. Intravital imaging–based analysis tools for vessel identification and assessment of concurrent dynamic vascular events. Nature Communications. 2018;9(1):2746. https://doi.org/10.1038/s41467‑018‑04929‑8.
Giampetraglia M., Weigelin B. Recent advances in intravital microscopy for preclinical research. Current Opinion in Chemical Biology. 2021;63:200–8. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2021.05.010.
Ishii M. Intravital imaging technology reveals immune system dynamics in vivo. Allergology International. 2016;65(3):225–7. https://doi.org/ 10.1016/j.alit.2016.05.001.
Lin Q., Choyke P. L., Sato N. Visualizing vasculature and its response to therapy in the tumor microenvironment. Theranostics. 2023;13(15):5223–46. https://doi.org/10.7150/thno.84947.
Отзывы читателей
