eng
Выпуск #7/2018
О. В. Градов, Ф. А. Насиров, А. Г. Яблоков
Безлинзовая гемоцитометрия на чипе со вторичным преобразованием сигналов / изображений клеток в рамках неканонической фотометрической модели
Безлинзовая гемоцитометрия на чипе со вторичным преобразованием сигналов / изображений клеток в рамках неканонической фотометрической модели
Просмотры: 2812
В настоящей работе рассматривается новый метод гемоцитометрии и количественного анализа форменных элементов крови на чипе, основанный на шлирен-проекциях образца крови на плоскость детектора и визуализации / фотометрическом картировании на уровне одиночных клеток с применением фотометрической модели Ломмеля-Зеелигера, что позволяет визуализировать клетки в объеме без использования объемного сканирования или оптической томографии. Приводятся результаты калибровочного использования данной техники на примере клеток крови нормального (условно здорового) донора.
DOI: 10.22184/1993-7296.2018.12.7.716.729
DOI: 10.22184/1993-7296.2018.12.7.716.729
Теги: correlograms of the blood cell aggregation lommel-seeliger photometric model on-chip-hemocytometry waveletgrams of the blood cell aggregation вейвлетограммы агрегации клеток крови гемоцитометрия на чипе коррелограммы агрегации клеток крови фотометрическая модель ломмеля-зеелигера
1. ВВЕДЕНИЕ
1.1. Зарубежные работы в области безлинзовой цитометрии на чипе
Первые зарубежные работы в области безлинзовой микроскопии крови и безлинзовой цитометрии восходят к 2008 году, когда были аннотированы, а впоследствии апробированы на референсных образцах элементарные и общедоступные техники безлинзовой цитометрии на чипе. Они были применены к нормальным эритроцитам, клеткам дрожжей и калибровочным микросферам для метрологической калибровки [1], а затем – апробированы для простого морфометрического анализа крови, выделявшего эритроциты, лейкоциты и тромбоциты [2]. Данные методы базировались на использовании стандартных типов КМОП-матриц. Такие стандартные светочувствительные элементы традиционно используются в большинстве цифровых фото-, видео- и веб- камер, обладающих красным – R, зеленым – G и синим – B каналами регистрации цветного изображения. В стандартной цифровой фотографии регистрируемый сигнал является интегральной характеристикой, собранной с нескольких пикселов. В случае контактной работы с клетками крови одному пикселу (в одной точке изображения) сопоставлен только один цвет, поэтому существенным технологическим достижением стал переход от обычного широкопольного безлинзового мониторинга в техниках LUCAS (Lensless Ultrawidefield Cell [monitoring] Array for Shadow [imaging]) к спектрозональному / цветовому мониторингу (Multi-Color LUCAS) [1].
Однако первичные вариации схемы данного метода были лишены нескольких свойств, которые являются фундаментальными для диагностики в реальном анализе крови. Во-первых, отсутствовала возможность работы с неокрашенными клетками. Поэтому при первоначальном использовании метода лейкоциты приходилось предварительно окрашивать. Во-вторых, отсутствовала трехмерная (3D) визуализация формы клеток крови в образце. Более того, реконструкция в технологиях голографической безлинзовой цитометрии на чипе требовала, в первую очередь, специальной цифровой обработки ("деконволюции") для перехода от амплитудного голографического образа клетки к планарному – не объемному – ее реконструированному изображению [3]. Аналогичная по сложности предварительная обработка требуется для фазовой голографии при безлинзовой микроскопии [4], которая также не дает псевдотрехмерных или трехмерных изображений клеток, но только их дифракционные картины / интерференционные паттерны. После процедуры восстановления по фазе, с точки зрения метрологического обеспечения, результаты измерений на безлинзовых чипах – микроцитометрах становятся близкими к результатам счета клеток с помощью обычного лабораторно-клинического импедансного счетчика Коултера [4]. Этот факт дает возможность говорить о перспективах автоматической интерепретации лейкоцитарной формулы крови технологиями безлинзовой голографической цитометрии на селективных чипах [5].
Так как трудно разработать методику метрологической аттестации флуоресцентного цитометрического метода, имплементируемого на чипе на КМОП-матрице, то эффективность анализа, подсчета и классификации клеток при использовании данного метода низкая. Причина кроется в том, что практически все типы клеток отображаются в нем интегральным по времени сигналом в виде гауссового пика диффузного свечения, а задача разделения эмиссии и пучка возбуждения на чипе является сложной и практически непреодолимой для пользователей (с нефизическим образованием, по крайней мере). Поэтому проблема метрологической аттестации флуоресцентного цитометрического метода пока не решена [6]. С точки зрения обеспечения прослеживаемости к эталону (метрологическое обеспечение единства измерений) меньшую методическую погрешность дает метод дифференциального интерференционного контраста (DIC) на чипе. Для применения этого метода требуется провести тонкую подстройку одноосного кристалла и поглощающего анализатора [7]. Причем метод выдает псевдоцветные изображения (в силу свойств DIC-метода, эквивалентно использованию оптики Номарского или Плуто). В голографическом случае с использованием некогерентных источников цифровая обработка голограмм, полученных с использованием DIC, восстанавливает дифференциальное фазово-контрастное изображение образца в широком поле зрения (24 мм2).
Еще один путь, ведущий к улучшению метрологических характеристик аналитики в безлинзовой голографической цитометрии крови, это – алгоритмическое (то есть имплементируемое с использованием компьютерных программ для обработки изображений) увеличение разрешения – метод сверхразрешения субпикселного уровня дискретизации [8]. До недавнего времени резольвометрические свойства и сложность обработки информации голографических цитометров на чипе препятствовали их внедрению в лабораторно-диагностическую и клиническую практику.
С точки зрения диагностики, прецеденты гематологического внедрения безлинзовой голграфической цитометрии на чипе имеют штучный характер, преимущественно ограничиваясь областью медицинской паразитологии на уровне индивидуальной неклинической самодиагностики в странах третьего мира и развивающихся странах. Так, апробированы компактные устройства сверхразрешающей голографической безлинзовой микроскопии на чипе для автоматизированной диагностики малярии [9]. О точности диагностики этого заболевания (то есть идентификации Plasmodium falciparum, P. falciparum и P. vivax по некоторой базе данных) автоматически говорит факт привлечения краудсорсинговых платформ и идентфикации клеток крови без верификации результатов анализа. Потому что систематизация материала в случае построения базы данных для определения малярийных плазмодиев осуществлялась неспециалистами в порядке "сетевой игры" [10]. Очевидно и само собой разумеется, что при любой метрологической точности голографического безлинзового цитометра как оптического устройства, этот метод при использовании некорректно валидированных баз данных морфометрии не может быть принят медиками для внедрения в технику диагностики.
Вероятно, это обстоятельство породило неприятие метода в среде специалистов, занимавшихся разработкой голографических цитометров. Поэтому уже в 2013 году они перешли от идеи безлинзовой цитометрии к идеям демократизации гематологического анализа вообще, в том числе – на камерофонах, уже появившихся к тому времени [11]. Основным преимуществом метода безлинзовой цитометрии оставалась компактность систем из-за отсутствия оптического тракта на линии сканирования и отсутствия линз. Это, в свою очередь, определяло экономическую эффективность метода. При этом эффективность или робастность (надежность) подобных систем диагностики достигается уже не за счет физической простоты безлинзового контактного цитометра, а в силу использования мощных алгоритмов глубинного обучения нейронных сетей, отвечающих за принятие диагностических решений [12]. Но в процессе восстановления фаз и реконструкции голографического изображения также используются нейронные сети [13], техники машинного обучения которых занимают много времени. Это может, в свою очередь, стать очередным препятствием на пути использования технологий безлинзовой цитометрии на чипе в гематологии.
История применения безлинзовой микроскопии в гематологии является классическим примером биомедицинской инженерии, не приемлемой в достаточной мере профессиональными медиками. Из-за этого метод принес много меньшую эвристическую / диагностическую ценность, чем это могло бы произойти в случае правильной расстановки приоритетов. Если рассматривать как итоговый результат биомедицинской инженерии продукт медицинского применения, то достаточно очевидно, что акценты измерений следует расставлять в области не столько метрологии, сколько квалиметрии диагностики; в области не столько инженерии, сколько гематологии. Группы исследователей, работавшие над данной тематикой с большим акцентом в биомедицинской области, по определению больше ориентированы на медицинскую практику и клиническую апробацию системы, чем на перманентное решение метрологических задач при создании регистрирующего устройства.
1.2. Отечественные разработки безлинзовых гемоцитометров на чипе
В России работы по безлинзовой цитометрии на чипе ведутся с 2009 года, если учитывать разработки конструкций, применимых в гематологии. Но эксперименты по фазокоррелометрическому анализу сигнала биомедицинских объектов с приборов с зарядовой связью и КМОП-матриц ведутся с 2007 года группами авторов данной статьи. Группа получила результаты экспериментов как с использованием лазерных, так и некогерентных источников излучения. Ряд работ, выполненных ранее в рамках российской коллаборации (институты РАМН, выпускающие кафедры вузов по физиологическим и анатомическим специальностям), привели к получению ряда ключевых результатов, не решаемых зарубежными командами. В базовый список результатов вошли работы, в ходе которых:
1. Показана применимость безлинзового спекл-интерферометрического, безлинзового спеклографического анализа не только для измерений и идентификации зрелых форменных элементов крови и получения как итогового результата расширенной лейкоцитарной формулы крови, но и для анализа пролиферативной активности и дифференцировки (для клеток костного мозга и на модельных культурах) [14]. Параллельно, в рамках инициативных НИР были найдены адекватные аппроксимации для морфологии разных типов модельных клеток (Пуанкаре и Хенона, Чирикова и Гумовского–Мира, Кеплера, Вольтерра, Дюфинга и Хенона–Хейлеса) [15]. Результатом этих работ 2009–2011 годов стало создание цитометров (гемоцитометров) на чипе с микрофлюидным чипом в формате камер для счета форменных элементов крови и спинномозговой жидкости, с использованием сеток которых проводится мониторинг разрешающей способности считывающих чипов ("резольвометрия на чипе") [16,17].
2. Для автоматизированной морфометрии и классификации клеток при безлинзовой цитометрии один из авторов статей [16–18] (Нотченко А. В.) создал программу глубинного обучения. Ее работа апробирована как на окрашенных препаратах крови, так и на срезах нервной ткани. Была обеспечена совместимость многоосной системы роботизированного позиционирования образца на автоматизированном столике Федорова (определяющем отчасти метрологическое преимущество нашей разработки по отношению к зарубежным аналогам), и системы сканирования клеток в лабораториях на чипе (в частности, клеток крови). Так в статьях [19, 20] показана трехмерная реконструкция клеток крови (см. рис. 10 в данных работах и соответствующий им рис. 2 в настоящей статье), что отсутствует в работах зарубежных коллег. Такая визуализация позволяет использовать разработки не только в целях цитометрии, но и для агрегометрии и коагулометрии. Иными словами, реконструкция по слайсам (то есть оптическим срезам) могла производиться не только в двумерном, но и в трехмерном варианте, равно как и идентификация типов клеток. Рис. 1, 2 поясняют данный подход и результаты его применения к клеткам крови (визуализация агрегации эритроцитов).
3. На мембраномиметических модельных структурах специфической для морфометрического определения гемолитических анемий и смежных состояний формы продемонстрирована применимость алгоритмики лазерной диагностики мембранопатий (на моделях микросфероцитов, эллиптоцитов, стоматоцитов, эхиноцитов, акантоцитов) [21]. К нашему сожалению, в силу материально-технических ограничений для валидации, приведших к неверной интерпретации некоторых позиций и механизма формирования 3D-изображения, указанная статья может рассматриваться как частично ошибочная и не может до выхода наших следующих работ в этой области быть использована в целях идентификации типов клеток.
4. Предложена схема картирования неоптических характеристик клеток / неоптических меток в безлинзовом цитометре на чипе. В ее основе – использование преобразователей сигнала гибридизируемых агентов с неоптической формой сигнала в оптический сигнал с позиционной чувствительностью (под гибридизируемыми агентами подразумеваются иммуномагнитные частицы, радиоизотопные метки, красители, используемые в качестве агентов фотодинамической диагностики, фотодинамической терапии, которые возбуждаются источниками излучения неоптического диапазона; etc.). То есть происходит привязка к конкретным клеткам и идентификация с конкретными классами клеток в базе данных, пополняемой техниками машинного обучения с учителем [22, 23]. В частности, в недавнем прошлом была отработана программа для измерений на гемоцитобластах (в экспериментальных условиях) [24]. Аналогичная программа аннотирована для проведения работ в области лимфологии [25].
Целью данной работы является демонстрация эвристической ценности результатов, получаемых с отечественной конструкции безлинзовых цитометров на чипе. Разработка позволяет не применять на стадии сбора первичных данных голографические технологии, а использовать для сбора данных многоугловое сканирование с планарной матрицы. В статье демонстрируются методы / алгоритмы обработки данных с безлинзовых цитометров на чипе. Их применение позволит гематологу не тратить время на предварительный анализ голограммы с использованием сложного математического аппарата.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Конструкция многоуглового гемоцитометра на чипе
Гемоцитометр построен на безлинзовой КМОП-матрице (для фиксации изображений образца) с позиционируемым под программируемыми углами / в различных системах координат источником излучения. В качестве источника излучения мы использовали либо спектрозональные светодиоды (красные – на AlGaAs, GaP и AlGaInP; зеленые – на InGaN, AlGaP и GaN; синие – на ZnSe, InGaN и SiC), либо лазерные диоды или DPSS-лазеры (твердотельные лазеры с диодной накачкой). Излучение лазера или некогерентного источника проецировали с заданной дискретностью шага на матрицу, на которой локализован образец (капля крови в поддерживаемых условиях).
В описываемой системе используется КМОП-сенсор смартфона iPhone 4S с размером пиксела 1,4 мкм. Для позиционирования источников излучения (LED / DPSS) под разными углами использован шаговый двигатель. Он управляется через аппаратно-программную среду "Arduino", принимающую команды G-CODE – языка программирования устройств с числовым программным управлением (Electronic Industries Alliance, стандарт RS274D; также – стандарт ISO 7-bit / ISO 6983-1 : 2009 или ГОСТ 20999-83). Программное обеспечение аппарата имеет возможность сохранения данных и передачи их на ЭВМ – приложение 645 PRO версии MKIII для регистрации качественной безлинзовой иллюстрации в формате со сжатием без потерь (в частности алгоритмами Лемпеля-Зива и Лемпеля-Зива-Велча для TIFF).
2.2. МАТЕРИАЛЫ И ОБРАЗЦЫ
Использовалась кровь условно-здорового анонимного донора, анализы которого, согласно данным независимой лаборатории, не показывали каких-либо патологий, способных влиять на результат измерений. Гепаринизацию и цитратный буфер применяли только для некоторых калибровочных проб с заведомо неинформативными с точки зрения диагностики результатами. На большей части проб было исследовано также и образование микроструктур (особо, при дегидратации пробы). Такие пробы не были подвергнуты обычно никакой предварительной пробоподготовке. Забор пробы осуществлялся ланцетом-скарификатором. Так как время от забора пробы до анализа не превышало, как правило, нескольких минут (с учетом экспонирования образца уже на чипе – иногда длилось дольше, до нескольких десятков минут), то консервации крови или иные предварительные манипуляции не требовались. Кровь вводилась на чип (безлинзовую матрицу) в объеме не более одной капли (от 5 до 130 мкл, в зависимости от чего изменялась продолжительность работы устройства в режиме регистрации).
2.3. Алгоритмы обработки данных и программное обеспечение
После регистрации данных приложением 645 PRO версии MKIII результаты импортировались в формат, совместимый с анализирующим ПО (с частичным изменением качества и размеров файла). Для восстановления трехмерной структуры образцов клеток крови не использовали обычные формулы фотометрических расчета (закон Бугера-Ламберта-Бера). Для этих целей брали фотометрическую модель Ломмеля-Зеелигера (Lommel-Seeliger). Эта модель используется преимущественно в астрофотометрии, геодезических и астрогеологических измерениях. Она состоит из экспоненциального члена и полинома четвертого порядка в фазовой функции. При этом на карту оптической плотности / реконструкцию клеток при измерении шлирен-методом (теневом) в псевдотрехмерной репрезентации накладывались изофоты клеток – то есть изолинии их локальных оптических характеристик.
Результирующее изображение с изолиниями оптических характеристик, сопоставленными клеткам, исследовалось в режиме реального времени (без отрыва от процесса измерений, in situ; либо напрямую с экрана) с помощью QAVIS – программного обеспечения, разработанного в Дальневосточном отделении РАН. Это ПО позволяет анализировать изображения с получением коррелограмм, вейвлетограмм, корреляционно-спектральных характеристик с идентификацией отдельных клеток / их типов по результату идентификации корреляционно-спектральных характеристик – интегрально-частотных характеристик (ИЧХ) и интегрально-пространственных характеристик (ИПХ). При этом врач-пользователь не должен разбираться в математических аспектах диагностики, так как дружественный пользовательский интерфейс GUI выдает информацию (с возможностью сохранения в файл) на интуитивно-понятном уровне вывода.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Результаты регистрации
На рис. 3 показаны результаты регистрации дегидратирующейся капли крови (размер >1 / 16 поверхности чипа). Регистрация проводилась с использованием теневого (шлирен-) метода построения рельефа, фотометрической модели Ломмеля-Зелигера (Lommel-Seeliger) при установочных параметрах на чипе 45° и 135°. На рис. 4 приведена псевдотрехмерная репрезентация клеток из того же образца с условной шкалой высот и наложением изофот. Исходя из этих изображений, можно видеть, что, не прибегая к технике голографии, а также оптической томографии, пользуясь безлинзовой регистрацией, LED и алгоритмом, построенным на модели Ломмеля-Зелигера, можно получить высококачественные графические / фотометрические репрезентации клеток крови. Уровень интерференционных артефактов вокруг клеток при данном подходе намного ниже, чем при использовании стандартных методов UCLA (группа А. Озкана, см. выше), применяемых для реконструкции безлинзовых голограмм. При получении данных изображений не использовались методы восстановления фазы и анализа волновых фронтов.
3.2. Детектирование агрегации эритроцитов
При хранении консервированной крови, при полиглобулии и при разных патологических и компенсаторных процессах, с изменением СОЭ, агрегация эритроцитов идет с выраженным формированием стопок эритроцитов (типа "монетных столбиков" и т. п. форм). Данный процесс (в англоязычной литературе известный как "rouleaux") может наблюдаться на цитометрической безлинзовой установке. Он может быть детектирован по изменению характеристик крови с использованием чипа этой установки. Продемонстрируем это далее. Так, на ранних стадиях дегидратации капли крови (первые десять минут; в зависимости от объема / толщины слоя) можно видеть формирование этих структур in situ на чипе в режиме реального времени. Результат соответствующих явлений показан на рис. 5. При этом можно с кинетическим качеством (в динамике и с позиционной чувствительностью) определить агрегометрические свойства образца по вейвлетограмме соответствующих цитометрических паттернов / файлов регистрограмм с безлинзового чипа. Врач не обязан владеть самой техникой анализа данных, поскольку статистические результаты анализа по выборкам клеток крови, проходящих через анализатор, могут быть поняты с морфологических позиций, за тем исключением, что предметом анализа и интерпретации морфологической картины являются не микрофотографии, а вейвлетограммы. На рис. 6 приведен результат подобного автоматического различения уровней и стадий агрегации для разных морфологических типов картин, определенных клиницистом: а – норма, b – частичная агрегация (что можно охарактеризовать как "цепочка"), c – полная агрегация ("стопка").
3.3. Коррелографическое определение
Для более точного определения классов клеток без использования для этих целей стандартных морфометрических баз данных рационально иметь строгие количественные критерии отличий клеток крови по данным анализа их физических морфологических свойств. Нами было показано, что у клеток крови достаточно мал разброс морфо-физических параметров нормальных форм относительно девиантных. Поэтому методы корреляционно-спектрального или интегрального частотного (интегральный пространственный – в существенно меньшей степени) анализа малоэффективны для построения изображений с безлинзового чипа. Причина кроется в том, что на одиночную клетку приходится малое количество пикселов, – это ведет к малой статистической достоверности (по выборке) анализа. Однако коррелографический подход как таковой работал намного лучше. Поэтому он оказался более предпочтителен в качестве метода анализа не только нормальных, но и девиантных форм клеток крови, включая мембранопатии. На рис. 7а внизу показан нормальный эритроцит (с инверсией контраста), а наверху – его коррелограмма, с явно оформленными деталями контраста. В случае анализа аморфного, с точки зрения чипа-анализатора, сгустка с достаточной оптической плотностью (рис. 7b – внизу) коррелограмма принимает характер частично упорядоченной структуры с большой долей диффузного "облака" (рис. 7b – верх). При обнаружении эритроцитов с измененной пропорцией и явным отклонением от сферической формы кореллограмма изменяется. В соответствии с полярностью ориентации данного форменного элемента на изображении (рис. 7с), также наблюдается при слипании нескольких не нормируемых по размеру клеток (например двух микросфероцитов). Когда в поле зрения (ROI) анализатора начинает формироваться "стопка" (но еще не столбик, который может содержать более десятка эритроцитов), картина коррелограммы качественно изменяется, демонстрируя пятна, возникшие в результате появления новых участников процесса на ROI (рис. 7d). Если на ROI фиксируется тень эритроцита, то ее коррелограмма имеет существенно менее выраженные пятна-полюса при сохранении центральной зоны той же структуры, что и у нормального эритроцита (рис. 7e). При наложении двух и более эритроцитов на кадре (без дополнительной адгезии / агрегации) есть возможность детектировать это по усилению отдельных зон пятен (см. рис. 7f), явных и для одиночного нормального эритроцита (рис. 7а). Причем на результат проекции будут влиять также взаимная ориентация эритроцитов, а также стратификация их на кадре (подлежащая и надлежащая клетка).
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, показано, что методы безлинзовой гемоцитометрии на чипе, реализуемые в рамках упрощенной российской модели устройства и альтернативной фотометрической модели Ломмеля-Зелигера, позволяют не только визуализировать, причем в квазтрехмерном варианте, клетки крови, но и морфологически классифицировать их с использованием вейвлетных и коррелографических техник. В настоящее время начато тестирование их на выборке препаратов с клетками – индикаторами различных мембранопатий.
5. БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы благодарят Российский фонд фундаментальных исследований за грантовую поддержку. Работа выполнена в рамках гранта РФФИ 16-32-00914\16.
ЛИТЕРАТУРА
1. Seo S., Su T. W., Erlinger A., Ozcan A. Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction // Cellular and Molecular Bioengineering, 2008, v.1, № 2–3, p.146.
2. Su T. W., Seo S., Erlinger A., Tseng D., Ozcan A. Towards Wireless Health: Lensless On-Chip Cytometry // Optics and Photonics News, 2008, v. 19, № 12, p. 24.
3. Seo S., Su T. W., Tseng D. K., Erlinger A., Ozcan A. Lensfree holographic imaging for on-chip cytometry and diagnostics // Lab on a Chip, 2009, v. 9, № 6, p. 777–787.
4. Seo S., Isikman S. O., Sencan I., Mudanyali O., Su T. W., Bishara W. et al. High-throughput lens-free blood analysis on a chip // Analytical chemistry, 2010, v. 82, № 11, p. 4621–4627.
5. Stybayeva G., Mudanyali O., Seo S., Silangcruz J., Macal M., Ramanculov E. et al. Lensfree holographic imaging of antibody microarrays for high-throughput detection of leukocyte numbers and function// Analytical chemistry, 2010, v. 82, № 9, p. 3736–3744.
6. Coskun A. F., Su T. W., Ozcan A. Wide field-of-view lens-free fluorescent imaging on a chip // Lab on a Chip, 2010, v. 10, № 7, p. 824–827.
7. Oh C., Isikman S. O., Khademhosseinieh B., Ozcan A. On-chip differential interference contrast microscopy using lensless digital holography // Optics Express, 2010, v. 18, № 5, p. 4717–4726.
8. Bishara W., Su T. W., Coskun A. F., Ozcan A. Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution // Optics express, 2010, v. 18, № 11, p. 11181–11191.
9. Bishara W., Sikora U., Mudanyali O., Su T. W., Yaglidere O., Luckhart S. et al. Holographic pixel super-resolution in portable lensless on-chip microscopy using a fiber-optic array // Lab on a Chip, 2011, v. 11, № 7, p. 1276–1279.
10. Ozcan A. Biogames: a platform for crowd-sourced biomedical image analysis and tele-diagnosis // Bulletin of the Southern California Academy of Sciences, 2014, v. 113, № 2, p. 114.
11. Zhu H., Sencan I., Wong J., Dimitrov S., Tseng D., Nagashima K. et al. Cost-effective and rapid blood analysis on a cell-phone // Lab on a Chip, 2013, v. 13, № 7, p. 1282–1288.
12. Rivenson Y., Göröcs Z., Günaydin H., Zhang Y., Wang H., Ozcan A. Deep learning microscopy// Optica, 2017,v. 4, № 11, p. 1437–1443.
13. Rivenson Y., Zhang Y., Gunaydin H., Teng D., Ozcan A. Phase recovery and holographic image reconstruction using deep learning in neural networks // Light: Science & Aplications, 2018 (in press); arXiv preprint arXiv:1705.04286.
14. Нотченко А.В., Градов О. В. Лазерний топологічний спекл-аналізатор проліферативної та диференціаційної активності в культуральному морфогенезi // Морфологiя, 2011, v. 5, № 4, p. 10–19.
Notchenko A. V., Gradov O. V. Lazernij topologіchnij spekl-analіzator prolіferativnoї ta diferencіacіjnoї aktivnostі v kul’tural’nomu morfogenezi // Morfologiya, 2011, v. 5, № 4, p. 10–19.
15. Bolkhovitinov A. S., Gradov O. V. Visualization of invariant sets of biomorphic dynamic systems // Mat. Morph., 2010; 9(3): 0421000004\0032.
16. Градов О. В., Нотченко А. В. Загальнодоступні морфогістохімічні лабораторії на чипі на базі сіток рахункових камер різних типів: мікрофлюїдні морфодинамічні робочі станцii // Морфологiя, 2012, v. 6, № 1, p. 5–19.
Gradov O. V., Notchenko A. V. Zagal’nodostupnі morfogіstohіmіchnі laboratorії na chipі na bazі sіtok rahunkovih kamer rіznih tipіv: mіkroflyuїdnі morfodinamіchnі robochі stancii // Morfologiya, 2012, v. 6, № 1, p. 5–19.
17. Нотченко А. В., Градов О. В. Элементарные морфометрические лаборатории на чипе на основе гемоцитометрических камер с радиочастотной идентификацией культур и трансляцией спектрозонально-гистохимического мониторинга // Журнал радиоэлектроники, 2012, № 2, URL: http://jre.cplire.ru/win/feb12/5/text.html
Notchenko A. V., Gradov O. V. Elementarnye morfometricheskie laboratorii na chipe na osnove gemocitometricheskih kamer s radiochastotnoj identifikaciej kul’tur i translyaciej spektrozonal’no-gistohimicheskogo monitoringa// Zhurnal radioelektroniki, 2012, № 2, URL: http://jre.cplire.ru/win/feb12/5/text.html
18. Notchenko A.V., Gradov O. V. Elementary morphometric labs-on-a-chip based on hemocytometric chambers with radiofrequency culture identification and relay of spectrozonal histochemical monitoring// Visualization, Image Processing and Computation in Biomedicine, 2013, Vol. 2, № 1, DOI: 10.1615/VisualizImageProcComputatBiomed.2013005968
19. Нотченко А. В., Градов О. В. Пятиосная роботизированная лазерная система и алгоритм цифровой обработки выходных данных для регистрации и морфотопологической идентификации клеточно-тканевых структур в гистоморфогенезе // Журнал радиоэлектроники, 2012, № 1, URL: http://jre.cplire.ru/jre/jan12/6/text.html
Notchenko A. V., Gradov O. V. Pyatiosnaya robotizirovannaya lazernaya sistema i algoritm cifrovoj obrabotki vyhodnyh dannyh dlya registracii i morfotopologicheskoj identifikacii kletochno-tkanevyh struktur v gistomorfogeneze // Zhurnal radioelektroniki, 2012, № 1, URL: http://jre.cplire.ru/jre/jan12/6/text.html
20. Notchenko A. V., Gradov O. V. A five-axis arm-manipulator laser system & an algorithm for digital processing of output data for recording and morpho-topological identification of cells and tissue structures// Visualization, Image Processing and Computation in Biomedicine, 2013, v. 2, № 1, DOI: 10.1615 / VisualizImageProcComputatBiomed.2013005967
21. Gradov O., Gradova M., Rybakov S., Jae Choon S. Inorganic Biomimetics for Clinical Hematology // Medical Health and Science Journal. 2010, v. 2, № 2, p. 10–17.
22. Gradov O.V., Jablokov A. G. Novel morphometrics-on-a-chip: CCD- or CMOS-lab-on-a-chip based on discrete converters of different physical and chemical parameters of histological samples into the optical signals with positional sensitivity for morphometry of non-optical patterns // Journal of Biomedical Technologies, 2016, № 2, p. 1–29.
23. Gradov O. V. Multi-functional microprobe lab-on-a-chip based on the active-pixel sensor with the position-sensitive cassette masks assembled from discrete converters of different biophysical and biochemical parameters into the optical response signals [invited paper] // International Journal of Modern Physics: Advances in Theory and Aplications, 2017, № 1, p. 23–28.
24. Gradov O. V., Jablokov A. G. Multiparametric lab-on-a-chip with miltiple biophysical signal converters as a novel tool for experimental stem cell biology and control equipment for hematopoetic stem cell transplantation // Cellular Therapy and Transplantation, 2017, Vol. 6, № 3:20, p. 41–42.
25. Градов О. В., Яблоков А. Г. Морфофизиологический / морфофункциональный анализ для лимфологических задач в микрофлюидных чипах // Трансляционная медицина, 2017, Приложение № 3, с. 14.URL: http://jre.cplire.ru/win/feb12/5/text.html
Gradov O. V., Yablokov A. G. Morfofiziologicheskij / morfofunkcional’nyj analiz dlya limfologicheskih zadach v mikroflyuidnyh chipah // Translyacionnaya medicina, 2017, Prilozhenie № 3, p. 14.
1.1. Зарубежные работы в области безлинзовой цитометрии на чипе
Первые зарубежные работы в области безлинзовой микроскопии крови и безлинзовой цитометрии восходят к 2008 году, когда были аннотированы, а впоследствии апробированы на референсных образцах элементарные и общедоступные техники безлинзовой цитометрии на чипе. Они были применены к нормальным эритроцитам, клеткам дрожжей и калибровочным микросферам для метрологической калибровки [1], а затем – апробированы для простого морфометрического анализа крови, выделявшего эритроциты, лейкоциты и тромбоциты [2]. Данные методы базировались на использовании стандартных типов КМОП-матриц. Такие стандартные светочувствительные элементы традиционно используются в большинстве цифровых фото-, видео- и веб- камер, обладающих красным – R, зеленым – G и синим – B каналами регистрации цветного изображения. В стандартной цифровой фотографии регистрируемый сигнал является интегральной характеристикой, собранной с нескольких пикселов. В случае контактной работы с клетками крови одному пикселу (в одной точке изображения) сопоставлен только один цвет, поэтому существенным технологическим достижением стал переход от обычного широкопольного безлинзового мониторинга в техниках LUCAS (Lensless Ultrawidefield Cell [monitoring] Array for Shadow [imaging]) к спектрозональному / цветовому мониторингу (Multi-Color LUCAS) [1].
Однако первичные вариации схемы данного метода были лишены нескольких свойств, которые являются фундаментальными для диагностики в реальном анализе крови. Во-первых, отсутствовала возможность работы с неокрашенными клетками. Поэтому при первоначальном использовании метода лейкоциты приходилось предварительно окрашивать. Во-вторых, отсутствовала трехмерная (3D) визуализация формы клеток крови в образце. Более того, реконструкция в технологиях голографической безлинзовой цитометрии на чипе требовала, в первую очередь, специальной цифровой обработки ("деконволюции") для перехода от амплитудного голографического образа клетки к планарному – не объемному – ее реконструированному изображению [3]. Аналогичная по сложности предварительная обработка требуется для фазовой голографии при безлинзовой микроскопии [4], которая также не дает псевдотрехмерных или трехмерных изображений клеток, но только их дифракционные картины / интерференционные паттерны. После процедуры восстановления по фазе, с точки зрения метрологического обеспечения, результаты измерений на безлинзовых чипах – микроцитометрах становятся близкими к результатам счета клеток с помощью обычного лабораторно-клинического импедансного счетчика Коултера [4]. Этот факт дает возможность говорить о перспективах автоматической интерепретации лейкоцитарной формулы крови технологиями безлинзовой голографической цитометрии на селективных чипах [5].
Так как трудно разработать методику метрологической аттестации флуоресцентного цитометрического метода, имплементируемого на чипе на КМОП-матрице, то эффективность анализа, подсчета и классификации клеток при использовании данного метода низкая. Причина кроется в том, что практически все типы клеток отображаются в нем интегральным по времени сигналом в виде гауссового пика диффузного свечения, а задача разделения эмиссии и пучка возбуждения на чипе является сложной и практически непреодолимой для пользователей (с нефизическим образованием, по крайней мере). Поэтому проблема метрологической аттестации флуоресцентного цитометрического метода пока не решена [6]. С точки зрения обеспечения прослеживаемости к эталону (метрологическое обеспечение единства измерений) меньшую методическую погрешность дает метод дифференциального интерференционного контраста (DIC) на чипе. Для применения этого метода требуется провести тонкую подстройку одноосного кристалла и поглощающего анализатора [7]. Причем метод выдает псевдоцветные изображения (в силу свойств DIC-метода, эквивалентно использованию оптики Номарского или Плуто). В голографическом случае с использованием некогерентных источников цифровая обработка голограмм, полученных с использованием DIC, восстанавливает дифференциальное фазово-контрастное изображение образца в широком поле зрения (24 мм2).
Еще один путь, ведущий к улучшению метрологических характеристик аналитики в безлинзовой голографической цитометрии крови, это – алгоритмическое (то есть имплементируемое с использованием компьютерных программ для обработки изображений) увеличение разрешения – метод сверхразрешения субпикселного уровня дискретизации [8]. До недавнего времени резольвометрические свойства и сложность обработки информации голографических цитометров на чипе препятствовали их внедрению в лабораторно-диагностическую и клиническую практику.
С точки зрения диагностики, прецеденты гематологического внедрения безлинзовой голграфической цитометрии на чипе имеют штучный характер, преимущественно ограничиваясь областью медицинской паразитологии на уровне индивидуальной неклинической самодиагностики в странах третьего мира и развивающихся странах. Так, апробированы компактные устройства сверхразрешающей голографической безлинзовой микроскопии на чипе для автоматизированной диагностики малярии [9]. О точности диагностики этого заболевания (то есть идентификации Plasmodium falciparum, P. falciparum и P. vivax по некоторой базе данных) автоматически говорит факт привлечения краудсорсинговых платформ и идентфикации клеток крови без верификации результатов анализа. Потому что систематизация материала в случае построения базы данных для определения малярийных плазмодиев осуществлялась неспециалистами в порядке "сетевой игры" [10]. Очевидно и само собой разумеется, что при любой метрологической точности голографического безлинзового цитометра как оптического устройства, этот метод при использовании некорректно валидированных баз данных морфометрии не может быть принят медиками для внедрения в технику диагностики.
Вероятно, это обстоятельство породило неприятие метода в среде специалистов, занимавшихся разработкой голографических цитометров. Поэтому уже в 2013 году они перешли от идеи безлинзовой цитометрии к идеям демократизации гематологического анализа вообще, в том числе – на камерофонах, уже появившихся к тому времени [11]. Основным преимуществом метода безлинзовой цитометрии оставалась компактность систем из-за отсутствия оптического тракта на линии сканирования и отсутствия линз. Это, в свою очередь, определяло экономическую эффективность метода. При этом эффективность или робастность (надежность) подобных систем диагностики достигается уже не за счет физической простоты безлинзового контактного цитометра, а в силу использования мощных алгоритмов глубинного обучения нейронных сетей, отвечающих за принятие диагностических решений [12]. Но в процессе восстановления фаз и реконструкции голографического изображения также используются нейронные сети [13], техники машинного обучения которых занимают много времени. Это может, в свою очередь, стать очередным препятствием на пути использования технологий безлинзовой цитометрии на чипе в гематологии.
История применения безлинзовой микроскопии в гематологии является классическим примером биомедицинской инженерии, не приемлемой в достаточной мере профессиональными медиками. Из-за этого метод принес много меньшую эвристическую / диагностическую ценность, чем это могло бы произойти в случае правильной расстановки приоритетов. Если рассматривать как итоговый результат биомедицинской инженерии продукт медицинского применения, то достаточно очевидно, что акценты измерений следует расставлять в области не столько метрологии, сколько квалиметрии диагностики; в области не столько инженерии, сколько гематологии. Группы исследователей, работавшие над данной тематикой с большим акцентом в биомедицинской области, по определению больше ориентированы на медицинскую практику и клиническую апробацию системы, чем на перманентное решение метрологических задач при создании регистрирующего устройства.
1.2. Отечественные разработки безлинзовых гемоцитометров на чипе
В России работы по безлинзовой цитометрии на чипе ведутся с 2009 года, если учитывать разработки конструкций, применимых в гематологии. Но эксперименты по фазокоррелометрическому анализу сигнала биомедицинских объектов с приборов с зарядовой связью и КМОП-матриц ведутся с 2007 года группами авторов данной статьи. Группа получила результаты экспериментов как с использованием лазерных, так и некогерентных источников излучения. Ряд работ, выполненных ранее в рамках российской коллаборации (институты РАМН, выпускающие кафедры вузов по физиологическим и анатомическим специальностям), привели к получению ряда ключевых результатов, не решаемых зарубежными командами. В базовый список результатов вошли работы, в ходе которых:
1. Показана применимость безлинзового спекл-интерферометрического, безлинзового спеклографического анализа не только для измерений и идентификации зрелых форменных элементов крови и получения как итогового результата расширенной лейкоцитарной формулы крови, но и для анализа пролиферативной активности и дифференцировки (для клеток костного мозга и на модельных культурах) [14]. Параллельно, в рамках инициативных НИР были найдены адекватные аппроксимации для морфологии разных типов модельных клеток (Пуанкаре и Хенона, Чирикова и Гумовского–Мира, Кеплера, Вольтерра, Дюфинга и Хенона–Хейлеса) [15]. Результатом этих работ 2009–2011 годов стало создание цитометров (гемоцитометров) на чипе с микрофлюидным чипом в формате камер для счета форменных элементов крови и спинномозговой жидкости, с использованием сеток которых проводится мониторинг разрешающей способности считывающих чипов ("резольвометрия на чипе") [16,17].
2. Для автоматизированной морфометрии и классификации клеток при безлинзовой цитометрии один из авторов статей [16–18] (Нотченко А. В.) создал программу глубинного обучения. Ее работа апробирована как на окрашенных препаратах крови, так и на срезах нервной ткани. Была обеспечена совместимость многоосной системы роботизированного позиционирования образца на автоматизированном столике Федорова (определяющем отчасти метрологическое преимущество нашей разработки по отношению к зарубежным аналогам), и системы сканирования клеток в лабораториях на чипе (в частности, клеток крови). Так в статьях [19, 20] показана трехмерная реконструкция клеток крови (см. рис. 10 в данных работах и соответствующий им рис. 2 в настоящей статье), что отсутствует в работах зарубежных коллег. Такая визуализация позволяет использовать разработки не только в целях цитометрии, но и для агрегометрии и коагулометрии. Иными словами, реконструкция по слайсам (то есть оптическим срезам) могла производиться не только в двумерном, но и в трехмерном варианте, равно как и идентификация типов клеток. Рис. 1, 2 поясняют данный подход и результаты его применения к клеткам крови (визуализация агрегации эритроцитов).
3. На мембраномиметических модельных структурах специфической для морфометрического определения гемолитических анемий и смежных состояний формы продемонстрирована применимость алгоритмики лазерной диагностики мембранопатий (на моделях микросфероцитов, эллиптоцитов, стоматоцитов, эхиноцитов, акантоцитов) [21]. К нашему сожалению, в силу материально-технических ограничений для валидации, приведших к неверной интерпретации некоторых позиций и механизма формирования 3D-изображения, указанная статья может рассматриваться как частично ошибочная и не может до выхода наших следующих работ в этой области быть использована в целях идентификации типов клеток.
4. Предложена схема картирования неоптических характеристик клеток / неоптических меток в безлинзовом цитометре на чипе. В ее основе – использование преобразователей сигнала гибридизируемых агентов с неоптической формой сигнала в оптический сигнал с позиционной чувствительностью (под гибридизируемыми агентами подразумеваются иммуномагнитные частицы, радиоизотопные метки, красители, используемые в качестве агентов фотодинамической диагностики, фотодинамической терапии, которые возбуждаются источниками излучения неоптического диапазона; etc.). То есть происходит привязка к конкретным клеткам и идентификация с конкретными классами клеток в базе данных, пополняемой техниками машинного обучения с учителем [22, 23]. В частности, в недавнем прошлом была отработана программа для измерений на гемоцитобластах (в экспериментальных условиях) [24]. Аналогичная программа аннотирована для проведения работ в области лимфологии [25].
Целью данной работы является демонстрация эвристической ценности результатов, получаемых с отечественной конструкции безлинзовых цитометров на чипе. Разработка позволяет не применять на стадии сбора первичных данных голографические технологии, а использовать для сбора данных многоугловое сканирование с планарной матрицы. В статье демонстрируются методы / алгоритмы обработки данных с безлинзовых цитометров на чипе. Их применение позволит гематологу не тратить время на предварительный анализ голограммы с использованием сложного математического аппарата.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Конструкция многоуглового гемоцитометра на чипе
Гемоцитометр построен на безлинзовой КМОП-матрице (для фиксации изображений образца) с позиционируемым под программируемыми углами / в различных системах координат источником излучения. В качестве источника излучения мы использовали либо спектрозональные светодиоды (красные – на AlGaAs, GaP и AlGaInP; зеленые – на InGaN, AlGaP и GaN; синие – на ZnSe, InGaN и SiC), либо лазерные диоды или DPSS-лазеры (твердотельные лазеры с диодной накачкой). Излучение лазера или некогерентного источника проецировали с заданной дискретностью шага на матрицу, на которой локализован образец (капля крови в поддерживаемых условиях).
В описываемой системе используется КМОП-сенсор смартфона iPhone 4S с размером пиксела 1,4 мкм. Для позиционирования источников излучения (LED / DPSS) под разными углами использован шаговый двигатель. Он управляется через аппаратно-программную среду "Arduino", принимающую команды G-CODE – языка программирования устройств с числовым программным управлением (Electronic Industries Alliance, стандарт RS274D; также – стандарт ISO 7-bit / ISO 6983-1 : 2009 или ГОСТ 20999-83). Программное обеспечение аппарата имеет возможность сохранения данных и передачи их на ЭВМ – приложение 645 PRO версии MKIII для регистрации качественной безлинзовой иллюстрации в формате со сжатием без потерь (в частности алгоритмами Лемпеля-Зива и Лемпеля-Зива-Велча для TIFF).
2.2. МАТЕРИАЛЫ И ОБРАЗЦЫ
Использовалась кровь условно-здорового анонимного донора, анализы которого, согласно данным независимой лаборатории, не показывали каких-либо патологий, способных влиять на результат измерений. Гепаринизацию и цитратный буфер применяли только для некоторых калибровочных проб с заведомо неинформативными с точки зрения диагностики результатами. На большей части проб было исследовано также и образование микроструктур (особо, при дегидратации пробы). Такие пробы не были подвергнуты обычно никакой предварительной пробоподготовке. Забор пробы осуществлялся ланцетом-скарификатором. Так как время от забора пробы до анализа не превышало, как правило, нескольких минут (с учетом экспонирования образца уже на чипе – иногда длилось дольше, до нескольких десятков минут), то консервации крови или иные предварительные манипуляции не требовались. Кровь вводилась на чип (безлинзовую матрицу) в объеме не более одной капли (от 5 до 130 мкл, в зависимости от чего изменялась продолжительность работы устройства в режиме регистрации).
2.3. Алгоритмы обработки данных и программное обеспечение
После регистрации данных приложением 645 PRO версии MKIII результаты импортировались в формат, совместимый с анализирующим ПО (с частичным изменением качества и размеров файла). Для восстановления трехмерной структуры образцов клеток крови не использовали обычные формулы фотометрических расчета (закон Бугера-Ламберта-Бера). Для этих целей брали фотометрическую модель Ломмеля-Зеелигера (Lommel-Seeliger). Эта модель используется преимущественно в астрофотометрии, геодезических и астрогеологических измерениях. Она состоит из экспоненциального члена и полинома четвертого порядка в фазовой функции. При этом на карту оптической плотности / реконструкцию клеток при измерении шлирен-методом (теневом) в псевдотрехмерной репрезентации накладывались изофоты клеток – то есть изолинии их локальных оптических характеристик.
Результирующее изображение с изолиниями оптических характеристик, сопоставленными клеткам, исследовалось в режиме реального времени (без отрыва от процесса измерений, in situ; либо напрямую с экрана) с помощью QAVIS – программного обеспечения, разработанного в Дальневосточном отделении РАН. Это ПО позволяет анализировать изображения с получением коррелограмм, вейвлетограмм, корреляционно-спектральных характеристик с идентификацией отдельных клеток / их типов по результату идентификации корреляционно-спектральных характеристик – интегрально-частотных характеристик (ИЧХ) и интегрально-пространственных характеристик (ИПХ). При этом врач-пользователь не должен разбираться в математических аспектах диагностики, так как дружественный пользовательский интерфейс GUI выдает информацию (с возможностью сохранения в файл) на интуитивно-понятном уровне вывода.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Результаты регистрации
На рис. 3 показаны результаты регистрации дегидратирующейся капли крови (размер >1 / 16 поверхности чипа). Регистрация проводилась с использованием теневого (шлирен-) метода построения рельефа, фотометрической модели Ломмеля-Зелигера (Lommel-Seeliger) при установочных параметрах на чипе 45° и 135°. На рис. 4 приведена псевдотрехмерная репрезентация клеток из того же образца с условной шкалой высот и наложением изофот. Исходя из этих изображений, можно видеть, что, не прибегая к технике голографии, а также оптической томографии, пользуясь безлинзовой регистрацией, LED и алгоритмом, построенным на модели Ломмеля-Зелигера, можно получить высококачественные графические / фотометрические репрезентации клеток крови. Уровень интерференционных артефактов вокруг клеток при данном подходе намного ниже, чем при использовании стандартных методов UCLA (группа А. Озкана, см. выше), применяемых для реконструкции безлинзовых голограмм. При получении данных изображений не использовались методы восстановления фазы и анализа волновых фронтов.
3.2. Детектирование агрегации эритроцитов
При хранении консервированной крови, при полиглобулии и при разных патологических и компенсаторных процессах, с изменением СОЭ, агрегация эритроцитов идет с выраженным формированием стопок эритроцитов (типа "монетных столбиков" и т. п. форм). Данный процесс (в англоязычной литературе известный как "rouleaux") может наблюдаться на цитометрической безлинзовой установке. Он может быть детектирован по изменению характеристик крови с использованием чипа этой установки. Продемонстрируем это далее. Так, на ранних стадиях дегидратации капли крови (первые десять минут; в зависимости от объема / толщины слоя) можно видеть формирование этих структур in situ на чипе в режиме реального времени. Результат соответствующих явлений показан на рис. 5. При этом можно с кинетическим качеством (в динамике и с позиционной чувствительностью) определить агрегометрические свойства образца по вейвлетограмме соответствующих цитометрических паттернов / файлов регистрограмм с безлинзового чипа. Врач не обязан владеть самой техникой анализа данных, поскольку статистические результаты анализа по выборкам клеток крови, проходящих через анализатор, могут быть поняты с морфологических позиций, за тем исключением, что предметом анализа и интерпретации морфологической картины являются не микрофотографии, а вейвлетограммы. На рис. 6 приведен результат подобного автоматического различения уровней и стадий агрегации для разных морфологических типов картин, определенных клиницистом: а – норма, b – частичная агрегация (что можно охарактеризовать как "цепочка"), c – полная агрегация ("стопка").
3.3. Коррелографическое определение
Для более точного определения классов клеток без использования для этих целей стандартных морфометрических баз данных рационально иметь строгие количественные критерии отличий клеток крови по данным анализа их физических морфологических свойств. Нами было показано, что у клеток крови достаточно мал разброс морфо-физических параметров нормальных форм относительно девиантных. Поэтому методы корреляционно-спектрального или интегрального частотного (интегральный пространственный – в существенно меньшей степени) анализа малоэффективны для построения изображений с безлинзового чипа. Причина кроется в том, что на одиночную клетку приходится малое количество пикселов, – это ведет к малой статистической достоверности (по выборке) анализа. Однако коррелографический подход как таковой работал намного лучше. Поэтому он оказался более предпочтителен в качестве метода анализа не только нормальных, но и девиантных форм клеток крови, включая мембранопатии. На рис. 7а внизу показан нормальный эритроцит (с инверсией контраста), а наверху – его коррелограмма, с явно оформленными деталями контраста. В случае анализа аморфного, с точки зрения чипа-анализатора, сгустка с достаточной оптической плотностью (рис. 7b – внизу) коррелограмма принимает характер частично упорядоченной структуры с большой долей диффузного "облака" (рис. 7b – верх). При обнаружении эритроцитов с измененной пропорцией и явным отклонением от сферической формы кореллограмма изменяется. В соответствии с полярностью ориентации данного форменного элемента на изображении (рис. 7с), также наблюдается при слипании нескольких не нормируемых по размеру клеток (например двух микросфероцитов). Когда в поле зрения (ROI) анализатора начинает формироваться "стопка" (но еще не столбик, который может содержать более десятка эритроцитов), картина коррелограммы качественно изменяется, демонстрируя пятна, возникшие в результате появления новых участников процесса на ROI (рис. 7d). Если на ROI фиксируется тень эритроцита, то ее коррелограмма имеет существенно менее выраженные пятна-полюса при сохранении центральной зоны той же структуры, что и у нормального эритроцита (рис. 7e). При наложении двух и более эритроцитов на кадре (без дополнительной адгезии / агрегации) есть возможность детектировать это по усилению отдельных зон пятен (см. рис. 7f), явных и для одиночного нормального эритроцита (рис. 7а). Причем на результат проекции будут влиять также взаимная ориентация эритроцитов, а также стратификация их на кадре (подлежащая и надлежащая клетка).
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, показано, что методы безлинзовой гемоцитометрии на чипе, реализуемые в рамках упрощенной российской модели устройства и альтернативной фотометрической модели Ломмеля-Зелигера, позволяют не только визуализировать, причем в квазтрехмерном варианте, клетки крови, но и морфологически классифицировать их с использованием вейвлетных и коррелографических техник. В настоящее время начато тестирование их на выборке препаратов с клетками – индикаторами различных мембранопатий.
5. БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы благодарят Российский фонд фундаментальных исследований за грантовую поддержку. Работа выполнена в рамках гранта РФФИ 16-32-00914\16.
ЛИТЕРАТУРА
1. Seo S., Su T. W., Erlinger A., Ozcan A. Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction // Cellular and Molecular Bioengineering, 2008, v.1, № 2–3, p.146.
2. Su T. W., Seo S., Erlinger A., Tseng D., Ozcan A. Towards Wireless Health: Lensless On-Chip Cytometry // Optics and Photonics News, 2008, v. 19, № 12, p. 24.
3. Seo S., Su T. W., Tseng D. K., Erlinger A., Ozcan A. Lensfree holographic imaging for on-chip cytometry and diagnostics // Lab on a Chip, 2009, v. 9, № 6, p. 777–787.
4. Seo S., Isikman S. O., Sencan I., Mudanyali O., Su T. W., Bishara W. et al. High-throughput lens-free blood analysis on a chip // Analytical chemistry, 2010, v. 82, № 11, p. 4621–4627.
5. Stybayeva G., Mudanyali O., Seo S., Silangcruz J., Macal M., Ramanculov E. et al. Lensfree holographic imaging of antibody microarrays for high-throughput detection of leukocyte numbers and function// Analytical chemistry, 2010, v. 82, № 9, p. 3736–3744.
6. Coskun A. F., Su T. W., Ozcan A. Wide field-of-view lens-free fluorescent imaging on a chip // Lab on a Chip, 2010, v. 10, № 7, p. 824–827.
7. Oh C., Isikman S. O., Khademhosseinieh B., Ozcan A. On-chip differential interference contrast microscopy using lensless digital holography // Optics Express, 2010, v. 18, № 5, p. 4717–4726.
8. Bishara W., Su T. W., Coskun A. F., Ozcan A. Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution // Optics express, 2010, v. 18, № 11, p. 11181–11191.
9. Bishara W., Sikora U., Mudanyali O., Su T. W., Yaglidere O., Luckhart S. et al. Holographic pixel super-resolution in portable lensless on-chip microscopy using a fiber-optic array // Lab on a Chip, 2011, v. 11, № 7, p. 1276–1279.
10. Ozcan A. Biogames: a platform for crowd-sourced biomedical image analysis and tele-diagnosis // Bulletin of the Southern California Academy of Sciences, 2014, v. 113, № 2, p. 114.
11. Zhu H., Sencan I., Wong J., Dimitrov S., Tseng D., Nagashima K. et al. Cost-effective and rapid blood analysis on a cell-phone // Lab on a Chip, 2013, v. 13, № 7, p. 1282–1288.
12. Rivenson Y., Göröcs Z., Günaydin H., Zhang Y., Wang H., Ozcan A. Deep learning microscopy// Optica, 2017,v. 4, № 11, p. 1437–1443.
13. Rivenson Y., Zhang Y., Gunaydin H., Teng D., Ozcan A. Phase recovery and holographic image reconstruction using deep learning in neural networks // Light: Science & Aplications, 2018 (in press); arXiv preprint arXiv:1705.04286.
14. Нотченко А.В., Градов О. В. Лазерний топологічний спекл-аналізатор проліферативної та диференціаційної активності в культуральному морфогенезi // Морфологiя, 2011, v. 5, № 4, p. 10–19.
Notchenko A. V., Gradov O. V. Lazernij topologіchnij spekl-analіzator prolіferativnoї ta diferencіacіjnoї aktivnostі v kul’tural’nomu morfogenezi // Morfologiya, 2011, v. 5, № 4, p. 10–19.
15. Bolkhovitinov A. S., Gradov O. V. Visualization of invariant sets of biomorphic dynamic systems // Mat. Morph., 2010; 9(3): 0421000004\0032.
16. Градов О. В., Нотченко А. В. Загальнодоступні морфогістохімічні лабораторії на чипі на базі сіток рахункових камер різних типів: мікрофлюїдні морфодинамічні робочі станцii // Морфологiя, 2012, v. 6, № 1, p. 5–19.
Gradov O. V., Notchenko A. V. Zagal’nodostupnі morfogіstohіmіchnі laboratorії na chipі na bazі sіtok rahunkovih kamer rіznih tipіv: mіkroflyuїdnі morfodinamіchnі robochі stancii // Morfologiya, 2012, v. 6, № 1, p. 5–19.
17. Нотченко А. В., Градов О. В. Элементарные морфометрические лаборатории на чипе на основе гемоцитометрических камер с радиочастотной идентификацией культур и трансляцией спектрозонально-гистохимического мониторинга // Журнал радиоэлектроники, 2012, № 2, URL: http://jre.cplire.ru/win/feb12/5/text.html
Notchenko A. V., Gradov O. V. Elementarnye morfometricheskie laboratorii na chipe na osnove gemocitometricheskih kamer s radiochastotnoj identifikaciej kul’tur i translyaciej spektrozonal’no-gistohimicheskogo monitoringa// Zhurnal radioelektroniki, 2012, № 2, URL: http://jre.cplire.ru/win/feb12/5/text.html
18. Notchenko A.V., Gradov O. V. Elementary morphometric labs-on-a-chip based on hemocytometric chambers with radiofrequency culture identification and relay of spectrozonal histochemical monitoring// Visualization, Image Processing and Computation in Biomedicine, 2013, Vol. 2, № 1, DOI: 10.1615/VisualizImageProcComputatBiomed.2013005968
19. Нотченко А. В., Градов О. В. Пятиосная роботизированная лазерная система и алгоритм цифровой обработки выходных данных для регистрации и морфотопологической идентификации клеточно-тканевых структур в гистоморфогенезе // Журнал радиоэлектроники, 2012, № 1, URL: http://jre.cplire.ru/jre/jan12/6/text.html
Notchenko A. V., Gradov O. V. Pyatiosnaya robotizirovannaya lazernaya sistema i algoritm cifrovoj obrabotki vyhodnyh dannyh dlya registracii i morfotopologicheskoj identifikacii kletochno-tkanevyh struktur v gistomorfogeneze // Zhurnal radioelektroniki, 2012, № 1, URL: http://jre.cplire.ru/jre/jan12/6/text.html
20. Notchenko A. V., Gradov O. V. A five-axis arm-manipulator laser system & an algorithm for digital processing of output data for recording and morpho-topological identification of cells and tissue structures// Visualization, Image Processing and Computation in Biomedicine, 2013, v. 2, № 1, DOI: 10.1615 / VisualizImageProcComputatBiomed.2013005967
21. Gradov O., Gradova M., Rybakov S., Jae Choon S. Inorganic Biomimetics for Clinical Hematology // Medical Health and Science Journal. 2010, v. 2, № 2, p. 10–17.
22. Gradov O.V., Jablokov A. G. Novel morphometrics-on-a-chip: CCD- or CMOS-lab-on-a-chip based on discrete converters of different physical and chemical parameters of histological samples into the optical signals with positional sensitivity for morphometry of non-optical patterns // Journal of Biomedical Technologies, 2016, № 2, p. 1–29.
23. Gradov O. V. Multi-functional microprobe lab-on-a-chip based on the active-pixel sensor with the position-sensitive cassette masks assembled from discrete converters of different biophysical and biochemical parameters into the optical response signals [invited paper] // International Journal of Modern Physics: Advances in Theory and Aplications, 2017, № 1, p. 23–28.
24. Gradov O. V., Jablokov A. G. Multiparametric lab-on-a-chip with miltiple biophysical signal converters as a novel tool for experimental stem cell biology and control equipment for hematopoetic stem cell transplantation // Cellular Therapy and Transplantation, 2017, Vol. 6, № 3:20, p. 41–42.
25. Градов О. В., Яблоков А. Г. Морфофизиологический / морфофункциональный анализ для лимфологических задач в микрофлюидных чипах // Трансляционная медицина, 2017, Приложение № 3, с. 14.URL: http://jre.cplire.ru/win/feb12/5/text.html
Gradov O. V., Yablokov A. G. Morfofiziologicheskij / morfofunkcional’nyj analiz dlya limfologicheskih zadach v mikroflyuidnyh chipah // Translyacionnaya medicina, 2017, Prilozhenie № 3, p. 14.
Отзывы читателей
